徐 洋， 尹文林， 姚嘉赟， 藺凌云， 袁雪梅， 潘曉藝， 沈錦玉

(農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省魚類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001)

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚：病魚采集自浙江省湖州市東林鎮(zhèn)保豐村黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)；健康黃顙魚購(gòu)自浙江省湖州市東林鎮(zhèn)南星田黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)，平均體質(zhì)量(100±2) g。

主要試劑：TSB、TSA和藥物敏感試紙，均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增通用引物合成和基因測(cè)序，均由生工生物工程(上海)有限公司完成；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑盒和DNA Marker，均為Biomiga公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)菌的分離

取所采集病樣的腦、肝、脾、腎臟接種于TSA培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑選單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，于TSB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液加甘油于-80 ℃保存，備用。

1.3 細(xì)菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)特征 將病原菌接種于TSB培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落的形態(tài)；挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，100倍油鏡下觀察菌體顏色與形態(tài)。

1.3.2 生理生化鑒定 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《細(xì)菌屬的鑒定指導(dǎo)》，將病原菌交由嘉興藍(lán)諾盛生物科技有限公司進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.3 16S rDNA基因序列測(cè)定 采用16S rDNA的通用引物，正向引物sgF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；反向引物SgR：5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ′進(jìn)行擴(kuò)增，目的片段長(zhǎng)度1 500 bp。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

1.4 毒力測(cè)定試驗(yàn)

將菌株10倍稀釋成106～1011CFU/mL的菌懸液，肌肉注射健康黃顙魚(100±2) g，注射0.1 mL/尾，對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS，每組放養(yǎng)30尾，試驗(yàn)組設(shè)置2組重復(fù)。水溫控制在(28±1) ℃，飼養(yǎng)觀察14 d，隨后記錄發(fā)病癥狀和死亡情況，并對(duì)死亡病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，細(xì)菌的半數(shù)致死量根據(jù)死亡率用改良寇氏法計(jì)算。

1.5 免疫原性試驗(yàn)

1.5.1 免疫原的制備 AW30726K于TSB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，活菌計(jì)數(shù)后離心用生理鹽水進(jìn)行稀釋，使菌濃度達(dá)到109CFU/mL，無(wú)需滅活即為弱毒株免疫原。

1.5.2 免疫接種 將所制備免疫原通過(guò)注射、浸泡及口服3種途徑對(duì)健康黃顙魚進(jìn)行免疫。注射免疫：采用腹腔注射接種0.1 mL/尾，每組注射50尾健康黃顙魚；對(duì)照組注射 0.1 mL/尾 無(wú)菌PBS，共注射50尾。浸泡免疫：采用短時(shí)浸泡免疫法，將免疫原以無(wú)菌PBS稀釋100倍，浸泡5 min，每組浸泡50 尾健康黃顙魚；對(duì)照組浸泡無(wú)菌PBS共50尾。口服免疫：0.1 mL/尾連續(xù)灌喂7 d，每組灌喂50尾健康黃顙魚；對(duì)照組灌喂0.1 mL/尾無(wú)菌PBS，連續(xù)灌喂7 d，共計(jì)50尾。試驗(yàn)期間，試驗(yàn)魚及對(duì)照組均每天早晚投喂飼料。

1.5.3 血清樣本的采集 上述免疫、對(duì)照組的黃顙魚分別于免疫接種7、14、21、28 d時(shí)，隨機(jī)采集3尾黃顙魚進(jìn)行尾靜脈采血，收集血清。

1.5.4 免疫效果評(píng)價(jià)

1.5.4.1 免疫保護(hù)力 免疫接種結(jié)束28 d后，腹腔注射 1 mL/尾 50倍LD50強(qiáng)毒株，免疫魚和對(duì)照魚一同攻毒，記錄各組的死亡情況，計(jì)算免疫保護(hù)率。

1.5.4.2 三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法 將收集的血清用三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)。具體方法如下：包被AW30726K抗原108CFU/mL，100 μL/孔，4 ℃過(guò)夜；PBST洗滌3次，加入封閉液，200 μL/孔，37 ℃孵育3 h；PBST洗滌3次，加入1 ∶100的免疫后待測(cè)魚血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h；PBST洗滌3次，加入1 ∶1 000的黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h；PBST洗滌3次，加入1 ∶1 000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，100 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h；PBST洗滌3次，加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃孵育20～30 min，加入2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，500 μL/孔；結(jié)果判定用自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取D450 nm值(P/N≥2.1 判為陽(yáng)性，P/N<2.1判為陰性)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離結(jié)果

從典型“裂頭病”病樣的腎臟中分離到1株細(xì)菌，暫命名為AW30726K。菌落特征為在TSA培養(yǎng)基上呈圓形光滑、隆起、半透明的灰白色小菌落，該菌落生長(zhǎng)緩慢，28 ℃培養(yǎng)48 h才能形成直徑為0.2 mm菌落。

2.2 病原菌的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，該菌為革蘭氏陰性菌，0.8 μm×2.0 μm。其形態(tài)特征為短桿狀、單生、不生芽孢、無(wú)莢膜(圖1)。

2.2.2 生理生化鑒定 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《細(xì)菌屬的鑒定指導(dǎo)》，由表1可知，初步確定病原菌為鲇魚愛(ài)德華氏菌Edwardsiellaictaluri。

表1 菌株的生化鑒定結(jié)果

注：+指陽(yáng)性；-指陰性；F指發(fā)酵型。

2.2.3 16S rDNA基因序列測(cè)定 病原菌經(jīng)細(xì)菌16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增后得到1 kb的片段，對(duì)基因核苷酸序列的同源性分析發(fā)現(xiàn)與鲇魚愛(ài)德華氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC33202)的保守性片段同源性為99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特征判定為鲇魚愛(ài)德華氏菌。

2.3 菌株的毒力

腹腔注射細(xì)菌懸液的人工感染方法能使健康的黃顙魚發(fā)病，且人工感染癥狀與自然發(fā)病癥狀相似，即病魚頭頂發(fā)紅、潰爛，腹腔有腹水等癥狀。人工感染的結(jié)果見(jiàn)表2。

改進(jìn)的寇氏法公式計(jì)算半數(shù)致死量的公式：lgLD50=Xk-d(∑Pi-0.5)，其中Xk為最大對(duì)數(shù)劑量，d為相鄰2組對(duì)數(shù)劑量之差數(shù)，Pi為死亡率，i為組號(hào)，可以計(jì)算出菌株對(duì)黃顙魚的半數(shù)致死量。

AW30726K株對(duì)黃顙魚的半數(shù)致死量lgLD50= lg(1010)-1×(10/30+6/30-0.5)=9.97，所以LD50=9.33×109CFU/mL。

表2 人工回感試驗(yàn)7 d內(nèi)死亡情況

2.4 免疫保護(hù)力

由表3可知，免疫效果以注射最佳，浸泡與口服的效果相近。

表3 弱毒株免疫試驗(yàn)結(jié)果

2.5 免疫效果評(píng)價(jià)

將所收集血清用三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)，由圖2可知，注射免疫效價(jià)最高，AW30726K弱毒活疫苗在免疫后21 d出現(xiàn)峰值。浸泡免疫效價(jià)次之，AW30726K弱毒活疫苗在免疫后21 d出現(xiàn)峰值。口服免疫效價(jià)不高，且與PBS對(duì)照差異不大。

3 討論

黃顙魚“裂頭病”最早報(bào)道于2008年[2]，其后在浙江、湖南、湖北等黃顙魚主養(yǎng)區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)該病例[3-8]。目前，對(duì)該病的病原研究已較為深入，大部分學(xué)者認(rèn)為其病原是鲇魚愛(ài)德華氏菌[3-6]，但也有相關(guān)研究表明引起該病的病原菌為遲鈍愛(ài)德華氏菌[9-10]，考慮與地域、環(huán)境等因素有關(guān)[11]。本研究從患“裂頭病”的黃顙魚體內(nèi)分離得到1株優(yōu)勢(shì)菌株，通過(guò)人工注射感染健康黃顙魚成功復(fù)制典型“裂頭病”癥狀，且從人工感染病樣體內(nèi)分離到相同菌株，證明這株優(yōu)勢(shì)菌為“裂頭病”病原菌。根據(jù)形態(tài)特征、理化特性結(jié)果，結(jié)合16S rDNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)分析，最終確定其為鲇魚愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)。這與周冬仁等、鄭善堅(jiān)等、徐進(jìn)等和耿毅等的研究結(jié)果[3-6]一致。

血清抗體效價(jià)結(jié)果表明，不同的免疫途徑效果差異明顯，注射效果優(yōu)于浸泡，浸泡效果優(yōu)于口服，但都在免疫后21 d出現(xiàn)峰值。雖然浸泡組和口服組免疫保護(hù)力相差不大，但血清抗體效價(jià)結(jié)果卻差距很大，這或許和口服組的細(xì)胞免疫和黏膜免疫有關(guān)，弱毒活疫苗誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，注射組雖然效果最佳，但在生產(chǎn)中難以操作，因?yàn)辄S顙魚通常在放苗前進(jìn)行疫苗免疫，其個(gè)體僅約20 g，注射免疫對(duì)其應(yīng)激較大，且操作成本很高[27]，浸泡和口服免疫保護(hù)率相近，雖然浸泡免疫最易操作，但由于弱毒活疫苗在浸泡中存在諸多的安全隱患[28]，因此研發(fā)適合口服的弱毒活疫苗將成為預(yù)防該病的最佳方式。