激動素對鹽脅迫下老芒麥幼苗端粒酶活性及生理特性的影響

孫守江，師尚禮，吳召林，何麗娟，金鑫，祁娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,甘肅省草業(yè)工程實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心,甘肅 蘭州730070)

鹽脅迫是限制植物生長、發(fā)育和分布的主要環(huán)境脅迫之一，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損失[1]，同時也是全球面臨的資源以及生態(tài)環(huán)境問題，全球的土地遭受鹽漬化侵害嚴重，中國約有25%的耕地面積已發(fā)生鹽漬化，嚴重制約了農(nóng)作物的生長發(fā)育[1]。鹽脅迫擾亂植物細胞內(nèi)正常的生理生化反應，打破細胞內(nèi)部離子平衡狀態(tài)，對植物造成一定的損傷[2]，如細胞膜通透性增大、葉綠素降解、光合速率降低，最終導致大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)積累[3]。高濃度的活性氧破壞植物細胞基本結(jié)構(gòu)，甚至對細胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)造成損傷，嚴重時會導致DNA斷裂以及蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，失去應有的功能[3]。特殊的端粒結(jié)構(gòu)序列導致其對活性氧超級敏感，端粒DNA序列的斷裂以及丟失導致端?？s短和功能失常[4]。

端粒(telomere)是存在于真核細胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復合體，它與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了特殊的“帽子”結(jié)構(gòu)，其主要作用是保持染色體的完整性和控制細胞分裂周期[4]。端粒、著絲粒和復制原點是染色體保持完整和穩(wěn)定的三大要素[5]。通常情況下，細胞每分裂一次都會使端粒變短，當縮短到一定程度時就會發(fā)出應急信號，細胞停止分裂[5]。端粒酶是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，它是由許多簡單短重復序列和端粒結(jié)合蛋白(telomere end-binding protein, TEBP)組成[4]。它的主要作用就是維持端粒有足夠的長度，保證基因信息在每個復制周期中的準確性，以防止染色體末端遺傳信息的丟失[4]。端粒酶對DNA具有一定的修復作用以及在真核細胞中能夠抵御活性氧帶來的細胞氧化損傷[6]，通過對人逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的研究發(fā)現(xiàn)，一定程度的DNA損傷可以增加hTERT的表達，使得端粒酶活性增加[7]，hTERT能夠增加DNA的自我修復能力以及修復速度。同時DNA末端合成能力也增強，進一步增加了DNA輕度損傷后植物細胞的存活概率。但是，強氧化脅迫導致植物細胞端粒酶活性降低，最終導致細胞死亡[7]。

關(guān)于植物細胞端粒系統(tǒng)對非生物脅迫響應的研究報道有限。Fojtová等[8]用鎘處理煙草(Nicotianatabacum)，發(fā)現(xiàn)一定程度的鎘脅迫導致煙草細胞氧化損傷，當移除鎘以后，發(fā)現(xiàn)煙草細胞凋亡速率降低，是因為煙草細胞受到氧化損傷以后具有一定程度的自我修復能力，在移除脅迫初期端粒酶活性明顯升高，由此可以看出，端粒酶在細胞受到氧化損傷以后，在自我恢復過程中發(fā)揮著重要作用。張徐俞等[3]將沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)作為研究材料，探究不同NaCl鹽脅迫程度下沙冬青細胞端粒酶活性變化與染色體DNA穩(wěn)定性的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)重度脅迫處理初期，端粒酶活性急劇增大，隨著處理時間的延長，活性逐漸減小，但是未見DNA降解的跡象；當移除NaCl處理后，端粒酶活性有所增加，通過觀察發(fā)現(xiàn)，DNA也未發(fā)現(xiàn)降解跡象，一直保持穩(wěn)定。由此可以看出端粒酶在抵御植物細胞氧化損傷、保持細胞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。吳曉飛等[2]用不同程度鹽脅迫處理沙冬青愈傷組織細胞，發(fā)現(xiàn)端粒酶對氧化損傷也具有一定的延緩和修復作用。

老芒麥(Elymussibiricus)是一種適應性較強，抗寒性較好的多年生中旱生植物，具有粗蛋白含量高、適口性好和易栽培等優(yōu)良特性，因此在西北、華北、東北等地常常被認為是一種營養(yǎng)價值較高的優(yōu)質(zhì)牧草[9]。關(guān)于老芒麥抗旱抗寒方面已有大量報道，在土壤遭受干旱鹽漬化程度日趨嚴重的今天，如何更好地利用老芒麥資源，改良土地鹽堿化仍然是目前面臨的瓶頸問題。外源人工合成激動素葉面噴施對作物光合特性、保護性酶及產(chǎn)量的影響報道較多，但是在牧草老芒麥上鮮有報道，基于此，本研究以野生老芒麥為材料，旨在探討不同程度鹽脅迫下，葉面噴施激動素對老芒麥幼苗端粒酶活性、膜脂過氧化物、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，為土壤鹽漬化地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及老芒麥人工草地改良提供理論依據(jù)和技術(shù)指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2015年采自甘肅天祝縣高寒草地的野生老芒麥種子。采樣地海拔2950 m；年均溫-0.1 ℃，最冷月(1月)平均氣溫為-18.3 ℃, 最熱月(7月) 平均氣溫為12.7 ℃，大于0 ℃年積溫1380 ℃；土壤pH為7.0～8.2；有機質(zhì)含量較高，介于8%～16%，速效氮0.017%，全磷0.067%。水熱同期；年均蒸發(fā)量1592 mm，沒有絕對無霜期。

1.2 試驗方法與設計

試驗于2018年2月在甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室組培室開展。選取大小一致、飽滿且無病蟲害的老芒麥種子，消毒處理后將其均勻撒在一次性口杯中，每杯50粒，覆蓋一層淺沙，每5杯放一個塑料培養(yǎng)盒，每個處理重復3次，共75杯，移至組培室培養(yǎng)，通風透光，每天澆灌適量蒸餾水。出苗后間苗，每杯保留生長一致、分布均勻的幼苗30株，待苗長至2～3 cm，澆Hoagland營養(yǎng)液[10]，每5 d換一次，每次換營養(yǎng)液之前用蒸餾水沖洗以防止鹽分積累。

設置5個氯化鈉濃度梯度(0、50、100、150、200 mmol·L-1)和5個激動素濃度梯度(0、5、10、20、30 mg·L-1，本研究分別用K1、K2、K3、K4、K5表示)對老芒麥幼苗進行處理，待老芒麥幼苗長至三葉期時進行鹽脅迫處理，將不同濃度的NaCl溶液澆至培養(yǎng)盆中，每盆0.5 L，每72 h處理一次，處理時間為168 h。168 h鹽脅迫處理后用不同濃度的激動素溶液在老芒麥葉面噴施，進行恢復處理，每72 h噴施一次，恢復時間為240 h。測定幼苗的端粒酶活性以及生理指標(葉綠素、游離脯氨酸、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白含量)。

1.3 試驗指標測定

1.3.1端粒酶活性測定 采用1994年Kim等[4]發(fā)明的末端序列重復擴增(TRAP)法，將0.3 g的老芒麥葉片放入預先制冷的研缽中，加入500 μL的TRAP buffer提取液，快速研磨成勻漿后，倒入1.5 mL離心管中，再加入500 μL TRAP buffer，在冰上放置30 min，12000 r·min-1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個新的離心管中，加入12%(m/V)PEG 8000，將離心管在-20 ℃冰箱放置沉淀60 min，離心后棄去上清，立即進行試驗或者放在超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。采?0 μL的反應體系：36 μL固相RNA清除劑處理水，5 μL TRAP buffer，1 μL dNTP mixture，1 μL TS21前導鏈引物，5 μL端粒酶提取物，26 ℃反應40 min，94 ℃變性2 min，然后再加入1.6 μL ACX后隨鏈引物和0.4 μL DNA聚合酶進行PCR 擴增。PCR結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳結(jié)束后，將凝膠置于SYBR Green I 染色液中，室溫染色1 h，用Quality one 軟件分析試驗結(jié)果。TRAP buffer配方為：50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol·L-1MgCl2，20 mmol·L-1EGTA (乙二醇雙四乙酸)，0.1 mmol·L-1PMSF(苯甲基磺酰氟)，5 mmol·L-1DTT (二硫蘇糖醇)，0.5%(m/V)CHAPS{3-[(3-膽酞胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸}，10%(m/V)甘油，0.1 mmol·L-1benzamidine(苯甲脒)，2 mmol·L-1spermidine(亞精胺)，1.5%(m/V)PVP。

1.3.2生理生化指標測定 葉綠素采用葉綠素含量測定儀對同一片葉的同一部位進行測定，每個處理隨機測定3片葉取平均值；游離脯氨酸采用酸性茚三酮法測定[11]；丙二醛采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定[11]；可溶性糖采用蒽酮法測定[11]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[11]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，Microsoft Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)并繪圖，差異顯著性定義為P<0.05，所有數(shù)據(jù)均為3個重復的平均值±標準誤(Mean±SE)。

表1 PCR 擴增過程中所用引物Table 1 The primers used in PCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鹽脅迫處理不同濃度激動素恢復對老芒麥幼苗端粒酶活性的影響

從圖1可以看出，隨著NaCl濃度的增大，端粒酶活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在50 mmol·L-1的NaCl鹽脅迫處理下，端粒酶活性達到最大值。當鹽脅迫處理濃度大于50 mmol·L-1時，端粒酶活性逐步減小。50 mmol·L-1的NaCl脅迫處理168 h，K2激動素恢復240 h，端粒酶活性升高為對照組的1.56倍；50 mmol·L-1的NaCl脅迫處理168 h，K3激動素恢復240 h，端粒酶活性升高為對照的1.67倍。從整理來看，隨著激動素處理濃度的增大，端粒酶活性逐漸上升，K5激動素恢復240 h以后，相比對照組端粒酶活性明顯升高。

2.2 不同鹽脅迫下不同濃度激動素恢復對老芒麥幼苗葉綠素含量的影響

從圖2可以看出，相比對照組，250 mmol·L-1的氯化鈉鹽脅迫處理下，老芒麥葉綠素含量減少差異顯著(P<0.05)，相比對照組減少了44.2%。鹽脅迫處理下，激動素恢復以后，抑制作用明顯得到緩解，而且隨鹽脅迫處理濃度的增大，緩解效果更加明顯。150 mmol·L-1鹽脅迫下K2、K3激動素處理相比對照差異顯著(P<0.05)，分別減少了5.0%、4.0%，而K4、K5激動素處理分別增長了5.0%、7.0%，可見在同一濃度鹽脅迫處理下，隨著激動素恢復濃度增大，緩解效果較明顯；250 mmol·L-1鹽脅迫下K3、K4激動素處理相比對照增加了18.7%、17.8%，K5激動素處理則減少8.2%。

圖1 不同濃度鹽脅迫處理不同濃度激動素對老芒麥幼苗端粒酶活性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of kinetin on telomerase activity in E. sibiricus seedlings under different salt stress

圖2 不同濃度鹽脅迫下不同濃度激動素恢復對老芒麥幼苗葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of kinetin on chlorophyll content in E. sibiricus seedlings under different salt stress

不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同。Different letters indicate significant difference among the treatments (P<0.05).The same below.

2.3 不同濃度鹽脅迫處理下不同濃度激動素恢復對老芒麥幼苗丙二醛含量的影響

從圖3可以看出，50,100,150 mmol·L-1鹽脅迫下老芒麥幼苗的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量相比CK依次減少了49.1%、23.4%、2.6%，而250 mmol·L-1鹽脅迫下卻增加了7.6%，可見適宜的鹽濃度可以降低MDA的含量，而鹽濃度越高，分泌的MDA越多。無鹽脅迫下K3激動素處理下MDA相比對照顯著減少64.9%(P<0.05)；150 mmol·L-1鹽脅迫下K2、K3激動素處理相比對照差異亦顯著(P<0.05)，分別減少了26.8%、42.2%；250 mmol·L-1鹽脅迫時，K3激動素處理相比對照MDA減少了50.0%。

2.4 不同濃度鹽脅迫下不同濃度激動素處理對老芒麥幼苗游離脯氨酸含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

從圖4可以看出，老芒麥幼苗游離脯氨酸含量隨著鹽濃度的增大逐漸增加，但各濃度處理間差異不顯著(P>0.05)。經(jīng)激動素處理后發(fā)現(xiàn)，0 mmol·L-1鹽脅迫下K5激動素相比對照增加566.0%；鹽濃度為50 mmol·L-1時，K2、K4、K5激動素處理相比對照差異顯著(P<0.05)，分別增長了782.8%、271.4%、394.9%；150 mmol·L-1鹽脅迫下K4激動素處理增加了625.0%。表明鹽脅迫下老芒麥幼苗體內(nèi)的游離脯氨酸含量增加，高鹽濃度處理下其含量更高，施加激動素處理后相比僅鹽脅迫處理其含量進一步增加，同一鹽濃度處理下的高濃度激動素處理增加量顯著(P<0.05)。

圖3 不同濃度鹽脅迫下不同濃度激動素處理對老芒麥幼苗丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of different concentration of kinetin on the content of malondialdehyde (MDA) of E. sibiricus seedlings under different salt stress

圖4 不同濃度鹽脅迫下不同濃度激動素處理對老芒麥幼苗游離脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of different concentration of kinetin on the content of free proline of E. sibiricus seedlings under different salt stress

圖5可以看出，250 mmol·L-1鹽濃度下可溶性糖含量顯著增加(P<0.05)，增長了101.5%，與其他各濃度相比，均達到了顯著性差異。與鹽脅迫處理相比，激動素處理又更進一步促進了其含量的增加，隨著鹽濃度的增大其促進效果先上升后下降，以100 mmol·L-1鹽濃度時激動素處理促進效果明顯。同一鹽濃度處理下，隨激動素濃度越高緩解效果越明顯。說明適宜濃度的鹽脅迫可以促進植物體內(nèi)可溶性糖含量的積累，激動素處理后促進作用更明顯。具體看來，外施激動素處理，50 mmol·L-1鹽脅迫下K2、K4激動素處理相比對照差異顯著(P<0.05)，分別增長了94.2%、77.6%；100 mmol·L-1鹽脅迫下K2、K4激動素處理差異顯著(P<0.05)，分別增長了77.1%、165.6%；250 mmol·L-1鹽脅迫下K4、K5激動素處理差異同樣顯著(P<0.05),分別增長了65.7%、66.0%。

可溶性蛋白含量在50、100、150 mmol·L-1鹽脅迫處理下相比CK差異顯著(P<0.05)，分別增長了47.6%、52.4%、66.7%。表明鹽濃度越高可溶性蛋白含量增加越明顯。無鹽脅迫處理下，K2、K3、K4、K5激動素處理相比對照差異顯著(P<0.05)，分別增長了74.6%、73.7%、68.4%、98.1%，可見同一鹽濃度處理下，隨激動素濃度的不斷增大可溶性蛋白增加量先減少后增大；50、100 mmol·L-1鹽脅迫下各處理差異不顯著；250 mmol·L-1鹽脅迫下K3、K5激動素處理分別增加了7.9%、12.7%。

圖5 鹽脅迫下不同濃度激動素處理對老芒麥幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of kinetin on soluble sugar content and soluble protein content in E. sibiricus seedlings under salt stress

3 討論

植物生長在鹽脅迫環(huán)境下，植物細胞內(nèi)會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)[12]，高濃度的活性氧導致植物細胞內(nèi)大分子物質(zhì)如遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及細胞結(jié)構(gòu)受到傷害[13-15]，研究結(jié)果表明，鹽脅迫處理嚴重影響了老芒麥幼苗的正常生長，隨著鹽脅迫處理濃度增大，阻礙作用越明顯。100 mmol·L-1的氯化鈉處理168 h以后，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)MDA含量明顯升高，游離脯氨酸大量外滲，說明此時細胞膜已經(jīng)受到破壞。氧化損傷誘導細胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)，使細胞正常生長受到阻礙，最終還會導致細胞直接死亡或程序性凋亡[16-17]。研究結(jié)果表明，100 mmol·L-1氯化鈉脅迫處理168 h以后，丙二醛(MDA)含量明顯上升，此時端粒酶活性明顯增強，說明細胞端粒酶活性的提高可能在一定程度上緩解鹽脅迫導致的氧化損傷，端粒酶在氧化損傷恢復和DNA修復方面發(fā)揮著重要的作用。端粒酶在維持端粒長度穩(wěn)定性方面起到重要的作用。本研究中，與低濃度氯化鈉相比較而言，當氯化鈉濃度超過100 mmol·L-1時，老芒麥端粒酶活性降低，結(jié)合前人的研究成果以及本研究結(jié)果可以明顯看出，端粒系統(tǒng)抵御逆境脅迫及氧化損傷的作用具有一定的閾值，過度的氧化損傷可能導致端粒酶結(jié)構(gòu)成分發(fā)生變化，最終導致端粒酶失去活性。植物生長狀態(tài)是內(nèi)外共同調(diào)控機制作用的結(jié)果，通過本研究可以看出，外源物質(zhì)(如激動素)也會起到一定的緩解作用。

外源物質(zhì)激動素能夠緩解鹽脅迫對植物的傷害，從而促進植物的生長[18]，主要通過促進植物地上，地下部分生物量的增加[18]，清除鹽脅迫下植物體內(nèi)自由基，減少活性氧、膜脂過氧化物的積累，刺激滲透調(diào)節(jié)物的大量產(chǎn)生，增強植物在不良環(huán)境下的生存能力[19]。本研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下，老芒麥幼苗的各指標在激動素處理下均得到了不同程度的緩解，如在0、150、250 mmol·L-1鹽脅迫下，10 mg·L-1激動素處理顯著降低了MDA含量(P<0.05)，分別減少了64.9%、42.2%、50.0%，而鹽脅迫下對大豆(Glycinemax)幼苗[20]用同濃度的激動素處理發(fā)現(xiàn)MDA含量也降低了，但是效果沒有老芒麥的明顯，可見適宜濃度的激動素能夠緩解鹽脅迫對老芒麥造成的傷害，進一步保護了其細胞膜系統(tǒng)；對苦馬豆(Sphaerophysasalsula)苗期的研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下6-BA處理游離脯氨酸含量相比鹽處理增加了，其主要機制是外源物質(zhì)提高了脯氨酸合成酶的活性[21]。本研究鹽脅迫下，不同濃度的激動素處理老芒麥，脯氨酸含量明顯增加，無鹽脅迫下，尤以30 mg·L-1顯著(P<0.05)，增加了566.7%，50、150 mmol·L-1鹽脅迫下激動素各濃度增加量亦顯著(P<0.05)，而苦馬豆[21]、番茄(Solanumlycopersicum)[22]的處理效果不到30%，表明激動素在老芒麥上的處理效果更明顯；可溶性蛋白含量在無鹽脅迫下，30 mg·L-1激動素處理增加了98.1%，這與鄭平生等[23]在草莓(Fragariaananassa)試管苗上的研究基本一致。試驗結(jié)果表明100 mmol·L-1鹽脅迫下，20 mg·L-1激動素處理可溶性糖含量增加顯著(P<0.05)，表明激動素處理更能促進鹽脅迫下老芒麥體內(nèi)可溶性糖含量的上升，維持細胞滲透環(huán)境。整體評價發(fā)現(xiàn)老芒麥在鹽脅迫下經(jīng)激動素處理各項抗性指標較理想，可以考慮在土壤鹽漬化地區(qū)生產(chǎn)以及老芒麥人工草地改良上借鑒使用。

4 結(jié)論

本研究從端粒酶活性和生理特性角度探討激動素對老芒麥幼苗適應鹽脅迫的影響。研究發(fā)現(xiàn)隨著NaCl鹽脅迫程度的增大，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均上升，經(jīng)激動素處理以后，MDA含量下降，葉綠素含量上升，可溶性糖含量上升，由此可以看出外源物質(zhì)激動素對鹽脅迫具有一定的緩解作用。適宜濃度的鹽脅迫誘導了細胞端粒酶活性，高濃度鹽脅迫可能造成了老芒麥細胞的氧化損傷，最終導致端粒酶活性下降。