余艷玲

(崇州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 崇州 611230)

前列腺癌是男性常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率都呈明顯上升趨勢[1]。前列腺癌早期沒有明顯臨床癥狀，當(dāng)累及膀胱出現(xiàn)膀胱刺激征或尿道梗阻時(shí)多數(shù)已至中晚期，失去了最佳的治療時(shí)機(jī)。據(jù)國外一項(xiàng)多中心、大標(biāo)本量的調(diào)查顯示，前列腺癌的早期診斷對患者療效和預(yù)后有積極意義，提升前列腺癌診斷效率已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)[2]。隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，更多高效、無創(chuàng)的檢查手段被應(yīng)用于惡性腫瘤診斷、預(yù)后判斷，微小RNA(miRNA)血清學(xué)檢測被認(rèn)為可能是腫瘤診斷的新方向[3]。筆者選擇前列腺癌患者為研究對象，聯(lián)合檢測患者血清miRNA-125b與miRNA-21水平，探討其對前列腺癌的診斷價(jià)值，以期為前列腺癌臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇崇州市人民醫(yī)院2014年1月至2016年1月收治的65例前列腺癌患者為研究對象，年齡范圍為39～72歲，<60歲者為27例，≥60歲者為38例；Gleason評分：≤7分為40例，>7為25例；病理分期：T1～2期患者37例，T3～4期患者28例；前列腺抗原(PSA)：<10 μg·L-1者為17例，≥10 μg·L-1者為48例； 20例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，45例未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)過影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室及病理檢查，診斷明確；②患者具備完整的病例資料；③收集標(biāo)本前患者均未進(jìn)行任何放療、化療或其他生物學(xué)治療；④患者一般情況可，無惡病質(zhì)發(fā)生。另選擇我院同期收治的良性前列腺增生患者65例(年齡范圍為35～68歲)、男性健康體檢者65例(年齡范圍為35～70歲)為對照。前列腺癌患者、良性前列腺增生患者、健康體檢者在年齡(χ2=1.329，P=0.475)等一般資料比較中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。所有納入研究者均知曉本研究目的、過程和意義，簽署知情同意書，本研究得到崇州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)支持。

1.2主要試劑與儀器低溫高速離心機(jī)(Thermo公司，美國)，血清總RNA提取試劑盒(碧云天，中國)，熒光定量PCR試劑盒(碧云天，中國)，ABI-7300熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)，引物設(shè)計(jì)與合成(上海生工)。

1.3方法在患者入院后次日清晨取空腹靜脈血清5 mL，促凝，靜置30 min，4 ℃、3 500 r·min-1離心5 min，取血清于1.5 mL離心管、-80 ℃冰箱保存待測。嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取血清總RNA，260/280吸光度在1.8～2.2之間為合格標(biāo)本，可進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：1 μg RNA，dNTP(5×RT)1.0 μL，RNA酶抑制劑(40 U·μL-1)0.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U·μL-1)0.2 μL，余以雙蒸水補(bǔ)足至20 μL，逆轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 35 min，42 ℃ 35 min，75 ℃ 10 min。完成cDNA后，以定量熒光PCR儀、熒光定量PCR試劑盒，來擴(kuò)增目的基因，U6為內(nèi)參基因，miRNA-125b、miRNA-21、U6引物序列見表1，反應(yīng)體系：cDNA產(chǎn)物1.0 μL，qPCR Mix10 μL(2×miRNA)，F(xiàn)orward primer、Reverse primer各 0.4 μL，余用dd水補(bǔ)齊至20 μL，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 320 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，均設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)RT-qPCR曲線得到Ct值，表示熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)，血清miRNA含量采用相對表達(dá)量2-△△Ct表示[4]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分布檢測，顯示miRNA含量2-△△Ct非正態(tài)分布，故以M(P25,P75)描述，組間比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)；不同病理特征血清miRNA量的差異采用MannWhitneyU檢驗(yàn)；采用受試者工作特征曲線(ROC)分析miRNA對前列腺癌診斷價(jià)值；前列腺癌患者、良性前列腺增生患者、健康體檢者間年齡比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；所有結(jié)果均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1三組血清miRNA-125b與miRNA-21比較前列腺癌患者血清miRNA-125b表達(dá)量為0.885(0.378，1.037)，顯著高于前列腺增生患者的0.332(0.121，0.625)(Z=3.891，P=0.008)，及健康體檢者的0.292(0.108，0.558)(Z=4.023，P=0.005)，前列腺增生患者與健康體檢者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.342，P=0.379)。前列腺癌患者血清miRNA-21表達(dá)量為2.015(1.285，2.572)，顯著高于前列腺增生患者的1.212(0.936，1.763)(Z=3.297，P=0.016)，及健康體檢者的1.378(1.002，1.956)(Z=3.081，P=0.019)，前列腺增生患者與健康體檢者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.365，P=0.348)。見圖1。

圖1 三組血清miRNA-125b與miRNA-21比較

2.2不同病理特征血清miRNA量的差異血清miRNA-125b在年齡>60歲、Gleason評分>7分、PSA≥10 μg·L-1、T3～4期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者顯著高表達(dá)(P<0.05)。血清miRNA-21在Gleason評分>7分、PSA≥10 μg·L-1、T3～4期患者顯著高表達(dá)(P<0.05)，與年齡、是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系(P>0.05)，見表2。

2.3血清miRNA-125b、miRNA-21對前列腺癌的診斷效率血清miRNA-125b診斷前列腺癌ROC曲線下面積(AUC)為0.799(95%CI：0.650～0.949)(P=0.001)，miRNA-21的AUC為0.733(95%CI：0.588～0.879)(P=0.009)，而miRNA-125b聯(lián)合miRNA-21診斷前列腺癌AUC為0.904(95%CI：0.798～0.982)(P=0.000)。見圖2。

圖2 血清miRNA-125b、miRNA-21對前列腺癌的診斷效率

3 討論

miRNA是長度約為20～22個(gè)核苷酸，進(jìn)化高度保守，在真核細(xì)胞廣泛存在的單鏈小分子RNA，其不具有編碼作用，但是可以通過誘導(dǎo)RNA降解或抑制RNA翻譯、表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物學(xué)行為[5-6]。隨著人類基因圖譜的不斷完善，發(fā)現(xiàn)超過50%的miRNA位點(diǎn)在腫瘤相關(guān)區(qū)域內(nèi)，提示miRNA表達(dá)失衡可能是惡性腫瘤發(fā)生的重要原因之一[7]，相關(guān)研究也證實(shí)，在多種惡性腫瘤組織內(nèi)有miRNA失衡表達(dá)[8]。miRNA可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化，抑制凋亡等方式參與腫瘤發(fā)生與進(jìn)展的調(diào)控[9]。既往的研究認(rèn)為miRNA只是在惡性腫瘤組織異常表達(dá)，但是隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在外周循環(huán)血也存在miRNA失衡表達(dá)[10]。血清miRNA在循環(huán)血中穩(wěn)定性高，輕易不被降解，大部分來自腫瘤組織或破裂腫瘤細(xì)胞，對腫瘤診斷、分期及預(yù)后判斷有一定提示作用，被認(rèn)為可能是腫瘤無創(chuàng)診斷的新方向[3]。miRNA在前列腺癌發(fā)病過程中的作用機(jī)制十分復(fù)雜，miRNA-32、miRNA-221、miRNA-222在前列腺癌高表達(dá)[10]，發(fā)揮“促癌”作用，而miRNA-145、miRNA-205在前列腺癌低表達(dá)，發(fā)揮“抑癌”作用[11]。Selth等[12]對前列腺癌患者血清miRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-141、miRNA-298、miRNA-375等顯著高表達(dá)，提示血清miRNA檢測可以作為前列腺癌潛在的診斷指標(biāo)。

miRNA-125b、miRNA-21作為常見癌基因，在肺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中都存在異常表達(dá)[13]，將二者聯(lián)合應(yīng)用于前列腺癌的診斷還鮮見報(bào)道。本研究選擇miRNA-125b、miRNA-21為研究靶基因，發(fā)現(xiàn)在前列腺癌患者外周循環(huán)血清中異常高表達(dá)，而良性前列腺增生患者和健康體檢者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miRNA-125b、miRNA-21在前列腺癌發(fā)病過程中可能扮演“促癌”作用。miRNA-125b是miRNA家族較為活躍的成員，尤其在惡性腫瘤發(fā)病研究較為深入，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，對腫瘤進(jìn)展起著十分重要的調(diào)控作用。miRNA-125b可以上調(diào)前列腺癌細(xì)胞雄激素非依賴性生長，并且可能通過干預(yù)BBC3、P53等抑癌基因表達(dá)來干預(yù)腫瘤細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)。Amir等[14]通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在LNCaP、PC-346C、22Rv1三種前列腺癌細(xì)胞株中miRNA-125b顯著高表達(dá)，并且可以通過調(diào)控致癌基因p14(ARF)/Mdm2信號通路及P53 凋亡通路來促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖。激素依賴的雄激素受體(AR)與前列腺癌發(fā)生關(guān)系密切，而miRNA-21可能與AR相關(guān)聯(lián)。Kotb等[15]通過對前列腺癌患者miRNA矩陣篩選，發(fā)現(xiàn)miRNA-21是雄激素誘導(dǎo)的miRNA之一。高水平miRNA-21不但可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和腫瘤形成，而且還可能誘導(dǎo)去勢治療后非雄激素依賴表型出現(xiàn)，導(dǎo)致去勢后發(fā)生拮抗現(xiàn)象[16]。

表2 不同病理特征血清miRNA量的差異/M(P25，P75)

我們的研究結(jié)果顯示miRNA-125b、miRNA-21在前列腺癌患者血清中都呈高表達(dá)現(xiàn)象，這也與其在前列腺癌組織表達(dá)情況相符合。Ribas等[17]通過對前列腺癌手術(shù)切除組織進(jìn)行miRNA-21表達(dá)量的檢測，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比較其上調(diào)幅度超過3倍。本研究對miRNA-125b、miRNA-21與前列腺癌患者病理特征關(guān)系進(jìn)行分析，miRNA-125b與年齡、Gleason評分、PSA濃度、T分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移都有一定關(guān)系，而miRNA-21僅與Gleason評分、PSA濃度、T分期相關(guān)，這可能是因?yàn)閙iRNA-125b較之于miRNA-21對腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)活性有更強(qiáng)的調(diào)控作用。血清miRNA-125b、miRNA-21對前列腺癌均有診斷價(jià)值，miRNA-125b診斷前列腺癌AUC為0.799，miRNA-21為0.733，但是二者聯(lián)合應(yīng)用AUC可以達(dá)到0.904，提示血清miRNA-125b、miRNA-21聯(lián)合檢測可以提高前列腺癌的診斷效率。

綜上所述，血清miRNA-125b、miRNA-21在前列腺癌患者高表達(dá)，與患者病理特征有一定關(guān)系，二者對前列腺癌均有一定診斷價(jià)值，但是聯(lián)合應(yīng)用可以提高其診斷效率。