石秀蘭，陳 平 ，于得水，韓瑞宏，劉 萍

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

狼尾草屬（Pennisetum Rich.）牧草是我國南方地區(qū)主要種植的牧草資源，具有生長快速、生物量大、利用價值高及耐瘠、耐肥、適應(yīng)性強(qiáng)等特點［1］，因此其應(yīng)用范圍延伸到水土保持、環(huán)境綠化、觀賞和能源燃料、造紙等多個方面［2-4］。狼尾草屬育種受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍重視，因此培育出不少新的狼尾草品種（系）。我國自1981年引進(jìn)美洲狼尾草和象草雜交種取得巨大經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益后，也在狼尾草屬牧草引種馴化、雜交育種等方面取得了明顯進(jìn)步。人工選擇以及環(huán)境等多因素的影響，使狼尾草屬牧草間易出現(xiàn)較大的遺傳分化［5］；植物遺傳距離和地理來源關(guān)系復(fù)雜化［6］，易導(dǎo)致育種工作者不能準(zhǔn)確地鑒定種質(zhì)來源和父母本的歸屬。

近年來，利用RAPD和ISSR分子標(biāo)記［7-11］對狼尾草屬牧草遺傳多樣性研究已有較多報道，為種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定、親本的合理選配奠定了理論基礎(chǔ)。但由于穩(wěn)定性、操作難度和可重復(fù)性方面的局限影響了標(biāo)記的準(zhǔn)確性［12］。相關(guān)序列多態(tài)性擴(kuò)增（sequence-related amplified polymorphism, SRAP）是以PCR為基礎(chǔ)的新型分子標(biāo)記方法［13］。該標(biāo)記方法因便捷、穩(wěn)定、高效等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、品種鑒定等方面［14-16］。姚法運等［17］利用SRAP技術(shù)分析了19份狼尾草資源間的遺傳關(guān)系，認(rèn)為SRAP技術(shù)具有很好的應(yīng)用價值。鑒于此，本研究以仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院選育的雜交狼尾草新品系1號、2號及生產(chǎn)中常用的狼尾草為研究對象，利用SRAP標(biāo)記進(jìn)行遺傳差異分析并構(gòu)建指紋圖譜，以期為狼尾草新品種的鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的狼尾草種質(zhì)材料共13份（表1）。選取長勢相近的植株，在相同葉位取樣，每株植株自下往上選取3片葉，同一植株不同莖均采取相同方法，目的是為了盡量選取相同植株上最嫩的葉片，以提高植物DNA活性，保持取樣方法一致。

1.2 基因組DNA提取

狼尾草基因組DNA提取參照于得水等［18］的方法，于0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。

1.3 SRAP-PCR擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)［19-21］的引物序列，選取正向引物6條、反向引物12條（表2），隨機(jī)組合成72對SRAP引物組合，對供試材料進(jìn)行擴(kuò)增。SRAP反應(yīng)采用25 μL體系：10×buffer 2.5 μL、Mg2+1.75 mmol/L、dNTPs 0.26 mmol/L、引物0.15 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA 50 ng；PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min、35℃退火1 min、72℃延伸2 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，4℃保存［20-22］。擴(kuò)增產(chǎn)物采用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離；參照Zhang等［23］的方法快速銀染檢測，在Vilber Lourmat CN1500凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

表1 供試?yán)俏膊莶牧霞爱a(chǎn)地

表2 SRAP-PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳結(jié)果分析擴(kuò)增條帶，參照文獻(xiàn)［20-21］方法，利用Quantity One軟件，以每個擴(kuò)增片段出現(xiàn)或缺失計為“1”或“0”，計算引物多態(tài)性條帶百分率（多態(tài)性帶數(shù)/總帶數(shù)×100%）；利用NTSYS－pc2.10軟件進(jìn)行Shonnon信息指數(shù)（I）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）、遺傳距離（GD）、相似系數(shù)（GSC）等參數(shù)的分析，采用UPGMA進(jìn)行聚類分析，繪制聚類圖；構(gòu)建13份狼尾草種質(zhì)材料的DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 狼尾草SRAP標(biāo)記的多態(tài)性

用72對SRAP引物對供試13份狼尾草材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的16對引物（表3）。從表3可以看出，16對引物擴(kuò)增出278條清晰條帶，平均每對引物擴(kuò)增17.37條清晰條帶，其中有218條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率平均為78.42%，分布范圍為68.18%～88.89%，其中最高引物組合為F1R5（88.89%），最低引物組合為F5R10（68.18%）；不同引物組合條帶擴(kuò)增數(shù)量有一定差異，其中引物組合為F3R5、F5R10條帶擴(kuò)增數(shù)量最多（22條），最少的條帶擴(kuò)增引物組合F1R1、F4R3（11條）；16對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物介于50～500 bp之間。引物組合F6R7擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 引物組合F6R7對狼尾草的擴(kuò)增結(jié)果

表3 16對引物擴(kuò)增條帶的多態(tài)性

2.2 13份狼尾草種質(zhì)遺傳多樣性

13 份狼尾草的遺傳相似度（GSC）為0.3776～0.9796，遺傳距離（GD）為0.0206～0.9740，說明各品種（系）間存在較大的遺傳差異。由表4可知，13份狼尾草材料中以皇竹草和矮生皇竹草的遺傳距離最近、為0.0206，遺傳相似度最高、為0.9796；以桂牧1號和多穗狼尾草的遺傳距離最遠(yuǎn)、為0.974，遺傳相似度最小、為0.3776。

Nei's 基因多樣性指數(shù)（H）和Shonnon信息指數(shù)（I）是衡量遺傳變異最常用的兩個指標(biāo)，13份狼尾草的平均H值為0.3306±0.1308，平均I值為0.5017±0.1587。不同品種狼尾草各基因位點遺傳多樣性程度存在較大差別，I最大值為0.6902，最小值為0；H最大值為0.4970，最小值為0。經(jīng)分析表明，狼尾草不同品種的遺傳多樣性較豐富，遺傳變異較大，說明SRAP標(biāo)記能夠很好地揭示狼尾草種質(zhì)資源間的遺傳差異。

2.3 13份狼尾草屬植物的DNA指紋圖譜

在16對擴(kuò)增帶型清晰、重演性好、多態(tài)性高的引物組合中，利用其中1對引物組合F6R7構(gòu)建了13份狼尾草屬植物的DNA指紋圖譜（圖2）。由圖2可知，圖譜含有DNA多態(tài)性條帶109條，多態(tài)性位點17個，帶型間有明顯差異，可有效區(qū)分13份狼尾草材料并加以準(zhǔn)確鑒定。

圖 2 13個狼尾草屬植物的DNA指紋圖譜

表4 狼尾草屬植物的的遺傳距離及遺傳相似度

2.4 13份狼尾草屬植物的聚類分析

根據(jù)相似系數(shù)矩陣按UPGMA法將13份狼尾草品種聚類，形成了13份種源的親緣關(guān)系聚類圖（圖3）。在遺傳相似度0.634處，將參試材料分為2大類：Ⅰ類包括雜交狼尾草、2份雜交狼尾草芽變系（雜交狼尾草1號、雜交狼尾草2號）及多穗狼尾草形成單獨分支；在相似度為0.884處，可分為2分支，雜交狼尾草及其2份芽變系聚為一類，多穗狼尾草單獨一類，其中雜交狼尾草2號芽變系的遺傳距離和雜交狼尾草原種更近些。Ⅱ類包括象草原品種、摩特矮象草及象草新品系、皇竹草及其矮生系、桂牧1號及3個地方品種單獨聚為一大類；在相似度為0.86處，可將Ⅱ類分為3個分支，皇竹草和其矮生系單獨聚為一類；桂牧1號、象草、江西象草湖光巖象草聚為一類，其中江西象草與桂牧1號的遺傳距離較近；摩特矮象草和象草新品系、華南象草聚為一類，其中摩特矮象草和象草新品系的遺傳距離相近聚為一類。

圖 3 13份狼尾草屬植物的UPGMA聚類結(jié)果

3 討論

3.1 13份狼尾草種質(zhì)聚類分析與品種實際來源的一致性

雜交狼尾草與其兩個芽變系（雜交狼尾草1號和2號）的遺傳距離分別為0.1423和0.0524。從分子水平上證明了仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院選育的雜交狼尾草1號和2號來源的準(zhǔn)確性，與陳平等［7］RAPD標(biāo)記的結(jié)果正好相符。由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的象草新品系及其源種摩特矮象草的遺傳距離為0.0852，也印證了解新明等［8］RAPD標(biāo)記的相關(guān)結(jié)論?；手癫菁捌浒档倪z傳距離最近為0.0206，相似度為98%，說明皇竹草矮生系的變異程度未達(dá)到以新品種的形式推廣種植，或許是由于其種植條件不同而造成皇竹草植株的矮化，推廣的地理位置不同而形成的植物適應(yīng)性表現(xiàn)。桂牧1號和地方品種江西象草的遺傳距離為0.0311，可由此推斷江西象草有可能是廣西的桂牧1號引種至江西后形成的一個適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂驐l件的地方品種，或者是由于天然雜交而導(dǎo)致的樣品不純。湖光巖雜交象草與桂牧1號、江西象草的遺傳距離相似，也可能是引種至當(dāng)?shù)睾笮纬傻牡胤叫缕贩N。桂牧1號是由美洲狼尾草和象草雜交后代F1回交所得。象草在整個遺傳育種過程中出現(xiàn)過2次，其遺傳基因也占據(jù)較大比例，象草與桂牧1號聚為一類，地方品種江西象草和湖光巖象草與源種象草聚為一類。華南象草于1960年從印尼引進(jìn)，在華南各地大量繁殖，進(jìn)而成為野外散生的地方品種，是我國最早引進(jìn)的牧草種質(zhì)，其后代不斷與其他狼尾草屬植物雜交導(dǎo)致基因序列改變，造成植物形態(tài)和生長習(xí)性與其源種差異顯著，它與摩特矮象草的遺傳距離較近（GD=0.1782），說明本地散生的華南象草與摩特矮象草有著某種遺傳關(guān)系。

3.2 SRAP標(biāo)記對狼尾草新品種鑒定的可行性

Budak等［24］以野牛草為材料，運用不同標(biāo)記方法研究，產(chǎn)生的多態(tài)性SRAP為95%、ISSR為81%、RAPD為79%和SSR為87%，認(rèn)為SRAP標(biāo)記好于其他幾種標(biāo)記。Ferrio等［25］認(rèn)為SRAP標(biāo)記重復(fù)性好于RAPD，相比AFLP操作更簡單，更貼近植物種源進(jìn)化史和形態(tài)變異，所用引物沒有物種特異性，尤其在研究背景缺乏的條件下優(yōu)勢明顯。對于自然變異后代來說，由于與其親本基因和形態(tài)的相似性，運用常規(guī)方法難以區(qū)分它們，甚至一些分子手段也不能將其完全區(qū)分［26］。狼尾草受環(huán)境條件影響易發(fā)生變異，本研究中，雜交狼尾草及其芽變系（雜交狼尾草1號和雜交狼尾草2號），摩特矮象草及其變異系（象草新品系），它們之間遺傳距離特別近，但是運用SRAP方法依然能夠清晰地鑒別出它們之間的差異。本研究也表明，利用SRAP引物建立的13份狼尾草屬品種的指紋圖譜，可以用于鑒定紛繁復(fù)雜的狼尾草屬不同變異系的品種（系）。姚運法等［17］的研究也證明了SRAP在狼尾草屬牧草品種間鑒定及分析遺傳關(guān)系方面具有很好的應(yīng)用價值。可見，SRAP標(biāo)記對狼尾草屬不同品種鑒定是可行的。