浙江中醫(yī)藥大學附屬寧波市中醫(yī)院 寧波 315012

近年來，隨著手機應用的日益廣泛，手機輻射對人體健康的危害日益受到人們的關注。睪丸是對電磁輻射最敏感的靶器官之一，研究顯示手機頻率的電磁輻射能夠導致小鼠睪丸支持細胞受損，使精子發(fā)生的微環(huán)境發(fā)生改變，從而影響正常精子的發(fā)生、發(fā)育[1]。紅景天苷（salidroside）是我國傳統藥用植物紅景天的主要有效成分,除存在于紅景天中外，還存在于楊柳科植物毛柳的樹皮、木樨科植物女貞子（Ligustrum lucidum Ait）的果實中，具有抗疲勞、抗衰老、免疫調節(jié)、清除自由基等作用[2]。近年來，研究發(fā)現紅景天具有良好的抗輻射效果[3]，但有關紅景天對睪丸組織輻射損傷是否具有保護作用還鮮有報道。因此，本研究原代培養(yǎng)大鼠睪丸支持細胞，模仿手機通話時的發(fā)射頻率和平均功率密度，同時以紅景天苷干預，探討手機輻射對睪丸支持細胞的損傷以及紅景天苷對睪丸支持細胞的保護作用，為深入研究紅景天苷在雄性生殖系統疾病中的臨床應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 熒光定量PCR儀Mx3000P型（美國Stratagene公司），普通PCR儀（德國Roche公司）,倒置顯微鏡（日本Olympus公司），CO2培養(yǎng)箱（德國Heraceu 公司），全球通系統數字手機（900 MHz），電磁輻射測定儀（標智GM3120）。DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國Hyclone公司（批號：0781003、SH30848.01B、SV30087.03）；Ⅱ型膠原酶（批號：C5100L0041）購自上海李記生物科技有限公司；Real-time PCR Master Mix購自TaKaRa公司（批號：BK1101）；FasL抗體和HRP標記的羊抗兔IgG抗體購自北京百奧萊博科技有限公司（批號：K15463、BL0817）；CCK-8購自上海碧云天生物技術公司（批號：CZ677）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GPx）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：20161021、20160916、20160925、20161023）；紅景天苷（純度≥97.5%）購于上海晶純生化科技股份有限公司（批號：MG0020）。

1.2 睪丸支持細胞原代培養(yǎng)及鑒定 睪丸支持細胞分離和培養(yǎng)方法參考文獻[4]，睪丸支持細胞通過速差貼壁法進行純化,采用特異FasL抗體免疫組化進行鑒定，細胞純度=（FasL陽性細胞數/細胞總數）×100%，純度達到90%后備用。將對數生長期的細胞消化后制備成5×104/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔體積0.2mL；另外制備2×104/mL的細胞懸液接種于24孔板，每孔體積0.5mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。

1.3 實驗分組及處理 將細胞分成5組，對照組、輻射組、輻射+低劑量紅景天苷組、輻射+中劑量紅景天苷組和輻射+高劑量紅景天苷組，每組5孔。對照組不作任何處理，其余各組細胞上方15cm處均放置頻率為900MHz、平均功率密度為370μW·cm-3的輻射源，接受24h/d，連續(xù)5d的輻射,期間更換充電裝置，暴露參數采用標智GM3120電磁輻射測定儀測定。同時根據預實驗結果，將配制好的紅景天苷分別加入輻射組+低劑量紅景天苷組、輻射組+中劑量紅景天苷組和輻射組+高劑量紅景天苷組中，使各組培養(yǎng)液中紅景天苷濃度分別為 100、200和 400μg·mL-1，各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)5d后備用。

1.4 檢測指標

1.4.1 CCK-8法測定細胞增殖活性 選對數生長期的細胞接種于96孔板內，各組細胞按上述方法培養(yǎng)后加入CCK-8 10μL，培養(yǎng)60min后酶標儀450nm測定各組吸光度值。

1.4.2 紫外分光光度法檢測細胞培養(yǎng)液SOD、CAT、GPx的活性和MDA的含量 細胞分組處理同前，收集24孔板內各組細胞培養(yǎng)上清液，用紫外分光光度計分別測定SOD、CAT、GPx活性及MDA含量，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 FQ-PCR檢測細胞雄激素結合蛋白（androgen binding protein，ABP）和抑制素 βB 亞基（inhibinβB，INHβB）mRNA表達 收集處理后的各組細胞，提取總RNA?？俁NA提取與cDNA合成按照試劑盒說明書操作，cDNA產物置于-20℃保存。各基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。反應體系參照說明書，反應條件：95℃預變性10min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，共 40 個循環(huán)，計算各組細胞中ABP和INHβB基因相對表達量，計算公式為 2-ΔΔCT。ΔCT1=對照組目的基因 CT 值-對照組內參基因CT值，ΔCT2=實驗組目的基因CT值-實驗組內參基因 CT值，ΔΔCT=ΔCT2-ΔCT1。

1.5 統計學分析 采用SPSS 11.5統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組間均數比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結果

2.1 大鼠睪丸支持細胞分離鑒定 原代睪丸支持細胞呈不規(guī)則形，細胞質中高表達FasL，免疫組化染色可見細胞質內大量棕黑色顆粒，證實為睪丸支持細胞，經鑒定純度＞95%。見圖1。

圖1 大鼠睪丸支持細胞FasL表達（200×）Fig.1 Expression of FasL in sertoli cells(200×)

2.2 各組大鼠睪丸支持細胞增殖活性比較 與對照組比較，輻射組大鼠睪丸支持細胞增殖活性明顯減弱（P＜0.01）。與輻射組比較，輻射+中、高劑量紅景天苷組細胞增殖活性增強（P＜0.01），增殖活性隨紅景天苷劑量增加而增加（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠睪丸支持細胞增殖活性比較Tab.2 Comparison of sertoli cell proliferation activity in each group

2.3 各組細胞氧化應激指標比較 與對照組比較，輻射組SOD、CAT和GPx活性均明顯降低，MDA含量明顯增高（均P＜0.01）。與輻射組比較，輻射+中劑量紅景天苷組和輻射+高劑量紅景天苷組SOD、CAT和GPX活性均有不同程度升高，MDA含量則顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。中、高劑量紅景天苷組細胞中SOD、CAT和GPx活性隨紅景天苷劑量增加而增加，MDA含量則隨紅景天苷劑量增加而降低（均P＜0.01）。見表 3。

表3 各組細胞氧化應激指標比較Tab.3 Comparison of cell oxidative stress indexes in each group

2.4 各組細胞ABP和INHβB mRNA表達比較與對照組比較，輻射組ABP和INHβB mRNA表達量明顯減少（均P＜0.01）。與輻射組比較，輻射+中劑量紅景天苷組和輻射+高劑量紅景天苷組ABP和INHβB mRNA相對表達量明顯增高（P＜0.05或P＜0.01）。中、高劑量紅景天苷組睪丸支持細胞ABP和INHβB mRNA相對表達量隨紅景天苷濃度增加而增加（均 P＜0.01）。見表 4。

表4 各組細胞ABP和INHβB基因mRNA相對表達量比較Tab.4 The mRNA relative expression of ABP and INHβB in each group

3 討論

當前，電磁技術的廣泛應用為人類的學習、生活和工作帶來諸多便利，同時也造成了環(huán)境的電磁污染，威脅人類的健康。生殖系統是對電磁輻射敏感的靶器官，持續(xù)電磁輻射可導致精液質量下降、睪丸氧化損傷，曲細精管的生精上皮變薄，支持細胞和間質細胞不同程度變性，最終可導致不育癥[5-6]。睪丸支持細胞在生精小管內為精子的發(fā)生發(fā)育提供保護和多種必要物質。INH是卵泡刺激素與其受體結合后，睪丸支持細胞特異性分泌的一種糖蛋白激素，對下丘腦-垂體-性腺軸中卵泡刺激素的產生起負反饋調節(jié)作用。INH有兩種形式：INH A（αβA）和INH B（αβB），男性體內主要為INH B。研究表明，INH B與精子發(fā)生有密切關系，其血清濃度降低常預示存在生精功能障礙，是目前已知的評價男性精子發(fā)生最好的內分泌標志物[7]。ABP是由睪丸支持細胞分泌的一種載體蛋白，對雄激素有高度親和力,ABP的存在使曲細精管管腔內的雄激素水平維持穩(wěn)定，為精子的分化和成熟提供保障。ABP分泌異?？蓪е虑毦芄芮粌鹊男奂に厮疆惓?，影響精子的分化和成熟[8]。本研究顯示，手機電磁輻射可引起睪丸支持細胞分泌ABP和INH βB降低，這可能是手機電磁輻射導致男性精液質量下降的原因之一。另外，多項研究表明手機電磁輻射能造成氧化損傷，影響精子質量[5-9]，而本研究也發(fā)現手機電磁輻射亦能使大鼠睪丸支持細胞培養(yǎng)液中MDA含量升高，抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性降低，提示手機電磁輻射能影響睪丸支持細胞抗氧化酶類活性，并造成睪丸支持細胞脂質損傷，與既往研究報道一致。

紅景天屬為多年生草本或亞灌木植物，我國有73種，其中大花紅景天產于海拔2 800～5 600m的高寒、缺氧、強紫外線照射的西藏地區(qū)，因紅景天苷含量豐富穩(wěn)定被中國藥典收錄。紅景天具有益氣活血、通脈平喘的功效，用于氣虛血瘀、胸痹心痛、中風偏癱、倦怠氣喘。紅景天能改善機體的適應性，能提高機體對抗各種化學、生物或物理因素刺激的能力，使紊亂的機能得到恢復，即“適應原樣”作用[10-11]。紅景天苷是紅景天的主要有效成分，現代藥理研究表明紅景天苷還具有抗缺氧、抗癌、抗抑郁、抗焦慮、抗炎以及抗氧化等多種功能[2]。近來研究表明紅景天苷具有良好的抗輻射功效，能有效對抗紫外線、X射線及60Coγ射線對機體造成的損害[3,12]。本研究結果顯示，紅景天苷可抑制手機電磁輻射對睪丸支持細胞分泌功能的損害，說明紅景天苷能對抗手機輻射對睪丸支持細胞造成的損傷，進而有助于精子的發(fā)生和發(fā)育。另外研究表明紅景天苷具有較強的抗氧化作用，能有效清除機體運動后產生的自由基[13]，而本研究中紅景天苷能有效提高睪丸支持細胞SOD、CAT和GPx活性，對抗手機輻射引起的抗氧化酶活性降低，從而減輕氧化應激造成的睪丸支持細胞損傷，提示紅景天苷在睪丸組織同樣具有抗氧化功效。

雄性生殖系統對輻射損傷極為敏感，而紅景天具有“適應原樣”作用，抗輻射功效明顯，因此紅景天在治療雄性生殖系統輻射損傷方面具有較高的潛在應用價值。本研究發(fā)現其對手機電磁輻射造成的睪丸支持細胞氧化受損具有保護作用，并對睪丸支持細胞蛋白分泌功能的恢復具有促進作用，為紅景天在傳統中醫(yī)男科治療電磁輻射損傷方面的應用提供了一定的實驗基礎。但輻射損傷對睪丸功能的損害是多方面的，如精子的營養(yǎng)、免疫因子的分泌、血睪屏障的構建等，因此紅景天苷在雄性生殖系統輻射損傷中的作用有待進一步深入研究。