司仙科 李煒 于昆 張計訓 曹亦軍 楊佳華

摘 要 目的：構(gòu)建針對人幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1（chitinase-3-like protein-1， CHI3L1）基因的短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA， shRNA）干擾表達載體，觀察CHI3L1基因表達對人胃癌細胞株BGC-823細胞增殖和侵襲能力的影響。方法：根據(jù)人CHI3L1基因序列設計并構(gòu)建CHI3L1基因的shRNA真核表達載體，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應和Western-Blot方法檢測BGC-823細胞的CHl3L1 mRNA和CHl3L1基因的表達，通過平板克隆形成實驗觀察BGC-823細胞的增殖情況，通過Transwell實驗觀察BGC-823細胞侵襲能力的變化。結(jié)果：建立了穩(wěn)定表達CHI3L1 shRNA的BGC-823細胞的CHI3L1 mRNA和CHI3L1基因的表達均顯著減少，且見CHI3L1 shRNA可顯著抑制BGC-823細胞的增殖和侵襲能力。結(jié)論：干擾CHI3L1基因的表達可顯著抑制BGC-823細胞的增殖和侵襲能力。

關鍵詞 胃癌 人幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1 增殖 侵襲

中圖分類號：R735.2 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）21-0062-04

Expression of human chitinase-3-like protein-1 in gastric cancer and its effect on proliferation and invasion of gastric cancer cells*

SI Xianke**， LI Wei， YU Kun， ZHANG Jixun， CAO Yijun， YANG Jiahua***（Department of General Surgery， Putuo Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200062， China）

ABSTRACT Objective： To construct a short hairpin RNA （shRNA） interference expression vector containing a gene encoding human chitinase-3-like protein-1 （CHI3L1） and observe the effect of CHI3L1 gene expression on the proliferation and invasion of human gastric cancer cell line BGC-823. Methods： The shRNA eukaryotic expression vector containing a gene encoding human CHI3L1 was designed and constructed based on CHI3L1 gene sequence and the transfection effect was observed by fluorescence microscopy. CHl3L1 mRNA and its gene expression in BGC-823 cells were detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction and Western-Blot. The proliferation and the invasion ability of BGC-823 cells were observed by clonogenic assay and Transwell method. Results： CHI3L1 mRNA and CHI3L1 expression in BGC-823 cells were significantly reduced and the proliferation and the invasion ability of BGC-823 cells were significantly inhibited by CHI3L1 shRNA. Conclusion： The expression of interference CHI3L1 can significantly inhibit the proliferation and invasion of gastric cancer cell.

KEy WORDS gastric cancer； human chitinase-3-like protein-1； proliferation； invasion

目前認為，胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個連續(xù)、復雜的主動過程，與多種相關基因和分子標志物有關[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，人幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1（chitinase-3-like protein-1， CHI3L1）在多種腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[2-3]。但對人CHI3L1在人胃癌細胞中的表達及其可能的意義卻迄今尚無系統(tǒng)性的研究。本實驗通過構(gòu)建靶向干擾人CHl3L1的重組慢病毒表達載體，觀察其對人胃癌細胞增殖和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

人胃癌細胞株BGC-823細胞和人胚腎上皮細胞株HEK 293T細胞（均由上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院提供）。

1.1.2 主要試劑與儀器

BCA蛋白定量試劑盒、化學發(fā)光檢測試劑盒和蛋白電泳制膠所需試劑（均為上海秀材生物技術有限公司產(chǎn)品）；RP-MI1640培養(yǎng)基、胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基（均為美國GIBCO公司產(chǎn)品）；慢病毒轉(zhuǎn)移載體pGMLV、重組穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pAX2（均為德國Qiagen公司產(chǎn)品）；聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction， PCR）試劑盒（日本Takara公司產(chǎn)品）。

熒光定量PCR儀、熒光顯微鏡和自動酶聯(lián)免疫分析儀（均由上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院中心實驗室提供）。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒干擾載體的構(gòu)建

針對目的基因CHI3L1基因，應用公用網(wǎng)站中提供的RNA干擾序列（XM 005244857.1 PREDICTED： Homo sapiens chitinase-3-like l， mRNA）設計原則，設計多個RNA干擾靶點序列，然后根據(jù)設計經(jīng)驗和設計軟件進行測定、評估，選擇具有最佳動力學參數(shù)的干擾靶點序列進入后續(xù)實驗流程。根據(jù)CHI3L1基因分別設計并合成3對短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA， shRNA）寡聚單鏈DNA，退火成雙鏈RNA，再將此3對雙鏈RNA的shRNA寡聚單鏈DNA序列的5 to 3序列分別插入至shRNA慢病毒載體中，構(gòu)建出3個shRNA慢病毒重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，最后成功構(gòu)建成pGMLV-SC1 RNAi慢病毒載體。

1.2.2 慢病毒的包裝

胰酶消化對數(shù)生長期的HEK 293T細胞，然后將其接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達60% ～ 70%時，加入質(zhì)粒和磷酸鈣的混合液，混勻后培養(yǎng)6 ～ 8 h。棄去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)液，清洗后再加入6 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集轉(zhuǎn)染72 h后的 HEK 293T細胞上清液，于4 ℃、4 000 r/min下離心10 min，然后以0.45 μm濾器過濾。超速離心（25 000 r/min）2 h，以冰磷酸鹽緩沖液重旋病毒沉淀，4 ℃下溶解過夜。

1.2.3 病毒滴度的測定

病毒滴度測定的前1天，對HEK 293T細胞進行傳代，96孔培養(yǎng)板上每個孔中加入100 μl的病毒原液（約5×104個細胞/ml），第2天確認細胞狀態(tài)沒有問題。準備3 ～ 5個無菌EP管，每管中加入90 μl DMEM完全培養(yǎng)基和10 μl待測病毒原液，輕輕混勻。吸去90 μl培養(yǎng)基，然后將稀釋好的病毒液從低濃度到高濃度依次加至培養(yǎng)板的孔中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后再在每孔中加入100 μl的新鮮培養(yǎng)基，小心操作，不要吹起細胞。72 h后，通過熒光顯微鏡計數(shù)熒光細胞，并結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染

將BGC-823細胞加至含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照操作說明書進行shRNA真核表達載體（shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3）和shRNA空白載體的轉(zhuǎn)染。對處于對數(shù)生長期的BGC-823細胞進行胰酶消化，制成細胞懸液，然后將細胞懸液（約含5×104個細胞）接種于6孔培養(yǎng)板上，于37 ℃、5% CO2恒溫箱中孵育24 h。將慢病毒和磷酸鈣的混合液按感染指數(shù)10∶1轉(zhuǎn)移至含單層細胞的培養(yǎng)液中并混勻，培養(yǎng)6 ～ 8 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)液。以磷酸鹽緩沖液沖洗3次，再在6孔培養(yǎng)板的每個孔中加入1 ml RP-MI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫箱中孵育48 h。應用免疫熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.5 Western-Blot實驗

制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠。電泳分離CHI3L1蛋白后轉(zhuǎn)膜，將膜取出，轉(zhuǎn)移至塑料自封袋中，加入10 ml封閉液靜置1 h。倒出封閉液，加入4 ml一抗溶液，于4 ℃下水平搖床上孵育過夜。室溫下，將膜在磷酸鹽緩沖液中浸洗3次，15 min/次。同一抗操作，取出膜，轉(zhuǎn)移至塑料自封袋中，加入4 ml二抗溶液，室溫下孵育1 h，然后再將膜在磷酸鹽緩沖液中浸洗3次，15 min/次。將混合后的檢測試劑均勻加至雜交膜上，反應3 ～ 5 min。用薄膜覆蓋雜交膜，趕出多余發(fā)光液，在暗房中壓片、顯影。

1.2.6 平板克隆形成實驗

將構(gòu)建好的穩(wěn)轉(zhuǎn)系細胞進行胰酶消化、計數(shù)，然后接種于6孔培養(yǎng)板上，每孔接種100個細胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，期間觀察細胞的生長狀態(tài)。應用4%多聚甲醛固定法室溫固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，掃描拍照。

1.2.7 Transwell實驗

向Transwell小室的上孔均勻加入已預作饑餓處理的細胞懸液，每孔中約5×104個細胞，再在上層加無血清培養(yǎng)基，下層加含血清的培養(yǎng)基，8 ～ 24 h后觀察細胞的穿透情況。應用4%多聚甲醛固定法室溫固定30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。用水沖洗掉結(jié)晶紫后，將上層細胞擦掉。隨機選擇5個視野，于顯微鏡下觀察上層細胞下底面的細胞。

2 結(jié)果

2.1 CHI3L1的慢病毒包裝及穩(wěn)轉(zhuǎn)系的構(gòu)建

從圖1可知，已在BGC-823細胞中成功構(gòu)建了CHI3L1的shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3穩(wěn)轉(zhuǎn)系。

2.2 Western-Blot實驗檢測BGC-823細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)系中CHI3L1的表達水平

從圖2可知，在已構(gòu)建了CHI3L1的shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3穩(wěn)轉(zhuǎn)系的BGC-823細胞中，CHI3L1的表達均顯著減少。

2.3 平板克隆形成實驗檢測CHI3L1 shRNA對BGC-823細胞增殖的影響

從圖3可知，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CHI3L1的shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3的BGC-823細胞的克隆數(shù)顯著減少，說明CHI3L1 shRNA-1、CHI3L1 shRNA-2和CHI3L1 shRNA-3均能顯著抑制BGC-823細胞的增殖。

2.4 Transwell實驗檢測CHI3L1 shRNA對BGC-823細胞侵襲能力的影響

從圖4可知，CHI3L1 shRNA-1、CHI3L1 shRNA-2和CHI3L1 shRNA-3均能顯著抑制BGC-823細胞的侵襲能力。

3 討論

CHI3L1基因位于1號染色體q32，由分布于8 kb區(qū)域上的10個外顯子構(gòu)成，含383個氨基酸。CHI3L1是結(jié)締組織細胞的生長因子，同時也是內(nèi)皮細胞之間形成黏附和發(fā)生遷移的重要因素[4]。CHI3L1與多種疾病相關，包括哮喘[5]、冠心病[6]、炎癥性腸病[7]、精神分裂癥和2型糖尿病等。近年研究還發(fā)現(xiàn)，CHI3L1水平升高與多種腫瘤的增殖、分化、浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關[8-11]。例如，Junker等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在小細胞肺癌中，CHI3L1的表達與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關；Pelloski等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中，CHI3L1的表達可引起腫瘤增殖，且與腫瘤對放療的不敏感性相關，致使預后不佳；付亮等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CHI3L1在膽囊癌中高表達，其表達水平與膽囊癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后密切相關。

RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術是一種采用雙鏈RNA誘發(fā)mRNA水平上的基因沉默、進而抑制蛋白產(chǎn)物表達的技術。Libreros等[15]應用RNAi技術抑制乳腺癌細胞中CHI3L1的表達，引起趨化因子配體-2、巨噬細胞炎性蛋白-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9等分泌減少，導致腫瘤增殖和侵襲能力減弱。Ku等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，應用RNAi技術使CHI3L1基因沉默、抑制CHI3L1的表達可抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖及侵襲能力。本實驗選用慢病毒構(gòu)建的RNAi表達載體使人胃癌細胞株BGC-823細胞的CHI3L1基因沉默，轉(zhuǎn)染成功后，通過PCR和Western-Blot實驗檢測發(fā)現(xiàn)，BGC-823細胞中的CHI3L1 mRNA水平和CHI3L1表達均受到抑制。此外，通過平板克隆形成實驗觀察到，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CHI3L1 shRNA的BGC-823細胞的增殖速率也顯著降低；通過Transwell實驗觀察到，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CHI3L1 shRNA的BGC-823細胞的侵襲能力亦顯著減弱，其中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CHI3L1 shRNA-2的BGC-823細胞的侵襲能力最弱。

Kawada等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細胞中，CHI3L1是主要通過激活胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases， ERK）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）信號通路而產(chǎn)生誘導白介素-8和單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1， MCP-1）分泌的。因此，我們猜測，CHI3L1在胃癌細胞中可能也是主要通過激活ERK和JNK信號通路而促進白介素-8和MCP-1的表達，進而促進胃癌細胞的增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移的。當然，確切的分子機制尚待我們未來實驗的深入研究。

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