陸吉虎,張雪花,梅 梅,侯繼波,唐應(yīng)華*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009)

隨著禽類養(yǎng)殖集約化、規(guī)模化發(fā)展，疫病流行日趨復(fù)雜并使疫苗防控難度逐步加大。雞新城疫(ND)、傳染性支氣管炎(IB)、減蛋綜合征(EDS)和禽流感(AI)均是由病毒引起的雞的傳染病，在養(yǎng)雞業(yè)中比較常見和多發(fā)，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。目前生產(chǎn)中主要采用接種滅活的油乳劑聯(lián)苗進(jìn)行防控。但是隨著疫苗的推廣使用，病原也在不斷發(fā)生變異，給防控工作帶來了一定的困難。免疫增強(qiáng)劑能提高動物機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，如PolyI:C[1]、CpG[2,3]、LPS[4]、脂多糖、囊素五肽(BP5)、神經(jīng)酰胺、咪喹莫特等多種動物天然免疫受體的激動劑在動物的免疫應(yīng)答過程中都發(fā)揮著重要的作用。免疫增強(qiáng)劑MF59在人用流感疫苗中已經(jīng)使用多年[5]，Intervet公司的豬圓環(huán)病毒疫苗和繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中都使用了DiluvacForte 佐劑[6]，Seppic公司的口蹄疫疫苗和新城疫疫苗分別添加使用了ISA206和ISA70佐劑[7]。

本試驗(yàn)室已經(jīng)篩選獲得可與疫苗配伍使用的系列復(fù)方免疫增強(qiáng)劑，并對該增強(qiáng)劑對禽流感疫苗以及禽用二聯(lián)疫苗的免疫增強(qiáng)效果進(jìn)行了評價(jià)[8-10]，本研究主要評價(jià)該免疫增強(qiáng)劑對禽用三聯(lián)或四聯(lián)滅活疫苗在海蘭褐殼蛋雞或羅曼蛋雞上的免疫增強(qiáng)效果，擴(kuò)大該免疫增強(qiáng)劑的適用范圍。

1 材料與方法

1.1 疫苗、試驗(yàn)雞及檢測抗原等材料

雞新城疫-傳染性支氣管炎-減蛋綜合征-禽流感(H9亞型)四聯(lián)油乳劑滅活疫苗(La Sota株+M41株+AV127株+HL株)(以下簡稱新-支-減-流四聯(lián)疫苗或四聯(lián)疫苗)，雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感(H9亞型)三聯(lián)油乳劑滅活疫苗(La Sota株+M41株+HL株)(以下簡稱新-支-流三聯(lián)疫苗或三聯(lián)疫苗)，均為市售商品化疫苗。1日齡海蘭褐殼蛋雞和羅曼蛋雞均購自江蘇海安某孵化場，普通環(huán)境中飼養(yǎng)。雞新城疫、禽流感(H9亞型)和減蛋綜合征檢測抗原均購自哈爾濱維科生物技術(shù)公司，傳染性支氣管炎(M41株)檢測抗原購自荷蘭GD公司。雞新城疫F48E8株、禽流感(H9亞型)SD01株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。ND、IB、EDS、AI(H9)陽性、陰性血清分別購自哈爾濱國生生物科技和哈爾濱威科生物技術(shù)公司。

1.2 含VA5免疫增強(qiáng)劑疫苗的配制

VA5免疫增強(qiáng)劑(以下簡稱VA5)為本實(shí)驗(yàn)室配制[8-9]。先將VA5與白油等按比例混合并充分乳化，然后與四聯(lián)疫苗或三聯(lián)疫苗按體積比為1∶9混勻即為含VA5免疫增強(qiáng)劑的疫苗。

1.3 VA5對四聯(lián)疫苗的免疫效力增強(qiáng)試驗(yàn)

1.3.1 海蘭褐殼蛋雞免疫含VA5的四聯(lián)疫苗試驗(yàn) 海蘭褐殼蛋雞飼養(yǎng)至10日齡分為3組(35只/組)，第1組免疫四聯(lián)疫苗，第2組免疫含VA5的四聯(lián)疫苗，第3組為生理鹽水對照組。頸背部皮下注射，0.3 mL/只。免疫后第1、第2和第3周每組隨機(jī)抽取5只雞用PBS緩沖液(10 mL/只)沖洗喉氣管，收集沖洗液；免疫后第2、第3和第4周每組隨機(jī)抽取20只雞采集翅靜脈血并分離血清。分別檢測上述沖洗液和血清針對新城疫(ND)、傳支(IB)(M41株)、減蛋綜合征(EDS)和禽流感(AI)(H9亞型)的血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)抗體效價(jià)(nlog2)(參照GB/T 16550-2008，新城疫診斷技術(shù))，統(tǒng)計(jì)各組效價(jià)的幾何平均值(Geometric mean titer，GMT)。

上述海蘭褐殼蛋雞免疫4周后分成2群，第1群(15只/組)用雞新城疫F48E8株強(qiáng)毒肌肉注射0.2 mL/只(含1.0×105.0EID50)(egg infectious dose，EID50雞胚半數(shù)感染劑量)，觀察14 d，記錄雞發(fā)病死亡情況，統(tǒng)計(jì)攻毒保護(hù)率[(攻毒總雞數(shù)-發(fā)病或死亡總數(shù))/攻毒總雞數(shù)×100]；第2群(15只/組)，以禽流感(H9亞型)SD01株(1.0×107.0EID50)進(jìn)行滴鼻攻毒，攻毒后的第1、第3、第5和第7天采集試驗(yàn)雞的喉氣管、泄殖腔棉拭子。取每只雞的2個(gè)拭子混合浸出液上清0.1 mL接種10日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，判定陽性率[10]。

1.3.2 羅曼蛋雞免疫含VA5的四聯(lián)疫苗試驗(yàn) 羅曼蛋雞飼養(yǎng)至10日齡時(shí)分為3組(25只/組)，分別免疫四聯(lián)疫苗、含VA5的四聯(lián)疫苗和生理鹽水。頸背部皮下注射，0.3 mL/只。免疫后第2、第3和第4周每組隨機(jī)抽取20只雞采集翅靜脈血并分離血清，檢測針對ND、IB、EDS、AI(H9亞型)的HI抗體效價(jià)。

1.4 VA5對三聯(lián)疫苗的免疫效力增強(qiáng)試驗(yàn)

選擇海蘭褐殼蛋雞的母源抗體(針對ND、IB、AI(H9亞型))HI效價(jià)≤2log2時(shí)進(jìn)行免疫。試驗(yàn)雞分為3組，每組20只。第1組免疫三聯(lián)疫苗，第2組免疫含VA5的三聯(lián)疫苗，第3組為生理鹽水對照組。頸背部皮下注射，0.3 mL/只。免疫后第2、3、4周采集雞翅靜脈血分離血清，檢測針對ND、IB、AI(H9亞型)的HI抗體效價(jià)，統(tǒng)計(jì)各組效價(jià)的幾何平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 VA5免疫增強(qiáng)劑提高新-支-減-流四聯(lián)疫苗對海蘭褐殼蛋雞的免疫效力

海蘭褐殼蛋雞免疫四聯(lián)苗后，第2、第3和第4周含VA5免疫增強(qiáng)劑組血清針對雞新城疫抗原的HI抗體效價(jià)均高于常規(guī)疫苗組，且第3、第4周HI抗體效價(jià)與常規(guī)疫苗組相比，均差異顯著(P<0.05)(圖1A)?？梢钥闯?，VA5可提高四聯(lián)疫苗對ND的HI抗體效價(jià)。

圖1 四聯(lián)苗對海蘭褐殼蛋雞的免疫效力Fig.1 Efficacy of inactivated tetravalent vaccine (ND-IB-EDS-H9) in Hy-line brown laying hen breeds

用雞傳染性支氣管炎抗原檢測血清HI抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，免疫后第2、第3和第4周含VA5免疫增強(qiáng)劑組血清HI抗體效價(jià)均高于常規(guī)疫苗組，且第3、第4周血清HI抗體效價(jià)與常規(guī)疫苗組相比，差異顯著(P<0.05)(圖1B)?？梢钥闯觯琕A5可提高四聯(lián)疫苗對IB的HI抗體效價(jià)。

用雞減蛋綜合征抗原檢測血清HI抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，免疫后第2、第3和第4周含VA5免疫增強(qiáng)劑組血清HI抗體效價(jià)均高于常規(guī)疫苗組。且第3、第4周血清效價(jià)與常規(guī)疫苗組相比，均差異顯著(P<0.05)(圖1C)?？梢钥闯觯琕A5可提高四聯(lián)疫苗對EDS的HI抗體效價(jià)。

用H9亞型禽流感抗原檢測血清HI抗體效價(jià)，免疫后第2周含VA5免疫增強(qiáng)劑組的血清HI抗體效價(jià)高于7log2，常規(guī)疫苗組第3周的血清HI抗體效價(jià)達(dá)到7log2以上。含免疫增強(qiáng)劑免疫組第3、第4周血清HI抗體效價(jià)與常規(guī)疫苗組相比，均差異顯著(P<0.05)(圖1D)?？梢钥闯觯琕A5可提高四聯(lián)疫苗對H9的HI抗體效價(jià)。

用新城疫、傳支(M41株)、減蛋綜合征和禽流感(H9亞型)抗原分別檢測免疫后雞喉氣管沖洗液的HI效價(jià)，結(jié)果顯示免疫后第1、第2和第3周含VA5免疫增強(qiáng)劑組粘膜HI抗體效價(jià)均高于常規(guī)疫苗組，且第2、第3周含VA5免疫組針對ND、IB、EDS和AI(H9亞型)的粘膜HI抗體效價(jià)與常規(guī)苗組相比均差異極顯著(P<0.01)(圖2A、2B、2C、2D)。可以看出，VA5可提高四聯(lián)疫苗對ND、IB、EDS和AI(H9亞型)的粘膜HI抗體效價(jià)。

圖2 免疫四聯(lián)疫苗的海蘭褐殼蛋雞的粘膜抗體效價(jià)Fig.2 Mucosal Antibody titers of inactivated tetravalent vaccine (ND-IB-EDS-H9) in Hy-line brown laying hen breeds

2.2 VA5免疫增強(qiáng)劑提高禽用新-支-減-流四聯(lián)疫苗對NDV和H9亞型AIV的攻毒保護(hù)力

免疫4周后以雞新城疫F48E8株強(qiáng)毒肌肉注射(1.0×105.0EID50)攻毒，結(jié)果顯示生理鹽水對照組全部死亡，四聯(lián)疫苗免疫組有2只雞出現(xiàn)精神不振、雞冠發(fā)紫等發(fā)病癥狀，保護(hù)率為87%(13/15)，含VA5的四聯(lián)疫苗免疫組無發(fā)病和死亡，保護(hù)率為100%(15/15)(表1)。由此可見，VA5免疫增強(qiáng)劑可以提高四聯(lián)疫苗對雞新城疫F48E8株的攻毒保護(hù)力。

以禽流感(H9亞型)SD01株進(jìn)行滴鼻攻毒，檢測雞喉氣管和泄殖腔棉拭子樣品。含VA5免疫增強(qiáng)劑的試驗(yàn)組均未檢測到病毒，而四聯(lián)苗免疫組在攻毒后第5天仍有2只雞檢測到病毒(2/15)，空白對照組在第7天有5只雞可以檢測到病毒(5/15)(表1)。由此可見，VA5可以提高四聯(lián)疫苗對禽流感(H9亞型)病毒的攻毒保護(hù)。

表1 蛋雞免疫四聯(lián)疫苗后NDV(IBV/ AIV)的攻毒保護(hù)率

dpc，攻毒后天數(shù)

dpc,days post challenge

2.3 VA5免疫增強(qiáng)劑提高禽用新-支-減-流四聯(lián)疫苗對羅曼蛋雞的免疫效力

分別用ND、IB、EDS、AI(H9亞型)的檢測抗原檢測羅曼蛋雞免疫四聯(lián)苗后第2周、第3周和第4周的血清，結(jié)果顯示含VA5免疫增強(qiáng)劑組免疫后第3周、第4周血清針對ND、IB、EDS、AI(H9亞型)的HI抗體效價(jià)均高于四聯(lián)疫苗免疫組并達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)(圖3A、3B、3C、3D)?？梢钥闯觯琕A5可提高四聯(lián)疫苗對羅曼蛋雞的免疫效力。

圖3 四聯(lián)疫苗對羅曼蛋雞的免疫效力Fig.3 Efficacy of inactivated tetravalent vaccine (ND-IB-EDS-H9) in Lohmann laying hen breeds

2.4 VA5免疫增強(qiáng)劑提高新-支-流三聯(lián)疫苗對海蘭褐殼蛋雞的免疫效力

海蘭褐殼蛋雞免疫三聯(lián)疫苗后，含VA5免疫增強(qiáng)劑組第2、3、4周針對雞新城疫抗原的血清HI抗體效價(jià)均高于常規(guī)疫苗組，且第3周和第4周血清效價(jià)與常規(guī)疫苗組相比，均差異顯著(P<0.05)(圖4A)。VA5提高三聯(lián)疫苗在海蘭褐蛋雞上對ND的HI抗體效價(jià)。

免疫后第2、3、4周含VA5免疫增強(qiáng)劑組血清針對雞傳染性支氣管炎抗原的HI抗體效價(jià)均高于三聯(lián)疫苗組。且VA5免疫增強(qiáng)劑組第4周血清效價(jià)與三聯(lián)疫苗組相比，差異顯著(P<0.05)(圖4B)。VA5能提高三聯(lián)疫苗在海蘭褐蛋雞上對IB的HI抗體效價(jià)。

免疫后第2周含VA5免疫增強(qiáng)劑組的血清針對H9的HI抗體效價(jià)高于三聯(lián)疫苗組且達(dá)7log2以上。含VA5免疫組第3、4周血清HI抗體效價(jià)與三聯(lián)疫苗組相比，均差異極顯著(P<0.01)(圖4C)。VA5 提高三聯(lián)苗在海蘭褐蛋雞上對AI(H9亞型)的HI抗體效價(jià)。

圖4 三聯(lián)疫苗對海蘭褐殼蛋雞的免疫效力Fig.4 Efficacy of inactivated trivalent vaccine (ND-IB-H9) in Hy-line brown laying hen breeds

3 討論

VA5免疫增強(qiáng)劑包含咪喹莫特、PolyI:C、神經(jīng)酰胺、胞壁酰二肽(MDP)等多種模式識別受體激動劑成分，并且不同單組分激動劑之間具有一定的協(xié)同效應(yīng)，參與雞體內(nèi)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[11]，可以提高針對禽流感(H5 /H9亞型)的HI抗體效價(jià)、提高攻毒保護(hù)率并延長有效抗體持續(xù)期[8-9]；在新城疫-傳染性法氏囊和新城疫-禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗中添加VA5同樣可以提高該二聯(lián)苗對雞的免疫效力[10]。

生產(chǎn)中為了減少免疫應(yīng)激，降低免疫成本并提高養(yǎng)殖綜合效益，多聯(lián)疫苗的使用將會逐步增多。本試驗(yàn)從體液免疫和攻毒保護(hù)率2個(gè)方面比較了含免疫增強(qiáng)劑的禽用三/四聯(lián)滅活苗與常規(guī)疫苗對蛋雞的免疫效果。VA5免疫增強(qiáng)劑與新-支-減-流四聯(lián)疫苗或新-支-流三聯(lián)疫苗共同免疫海蘭褐殼蛋雞以及VA5免疫增強(qiáng)劑與新-支-減-流四聯(lián)疫苗共同免疫羅曼蛋雞后能明顯提升針對ND、IB、EDS和AI(H9亞型)的血清HI抗體滴度，且第3和4周血清抗體滴度與常規(guī)疫苗組相比差異均顯著(P<0.05)。該結(jié)果與在禽流感(H9或H5亞型)滅活疫苗、禽用二聯(lián)滅活疫苗(新城疫-法氏囊二聯(lián)滅活疫苗和新城疫-禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗)中添加VA5免疫增強(qiáng)劑的免疫增強(qiáng)效果一致[8-11]。含VA5免疫增強(qiáng)劑組針對ND、IB、EDS和AI(H9亞型)的粘膜HI抗體效價(jià)也遠(yuǎn)高于不添加VA5的免疫對照組。這應(yīng)該是VA5免疫增強(qiáng)劑中的咪喹莫特、PolyI:C等激動劑成分與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞表面的TLRs等受體結(jié)合后激活細(xì)胞，增強(qiáng)了機(jī)體的免疫應(yīng)答[1,11-13]，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生更高滴度的抗病毒抗體。毛光明等[14]發(fā)現(xiàn)在免疫新城疫疫苗前后同時(shí)注射PolyI:C可以明顯提高血清中抗新城疫病毒抗體；Zhang等[15]把PolyI:C與PRRS滅活疫苗共同免疫動物也誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的血清抗體。VA5中咪喹莫特、PolyI:C等不同單組分激動劑之間具有協(xié)同效應(yīng)[11]，因此在疫苗中添加VA5較單一使用某種激動劑具有更好的免疫增強(qiáng)效果。另外VA5免疫增強(qiáng)劑也能夠提高雞外周血淋巴細(xì)胞增值，提高CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的比例，并誘導(dǎo)IL-4和IFN-γ細(xì)胞因子分泌[11,16-17]，從而增強(qiáng)了機(jī)體的抗病毒感染的能力。因此在本試驗(yàn)中對免疫雞用雞新城疫強(qiáng)毒攻擊，含VA5免疫增強(qiáng)劑組獲得了100%的保護(hù)；用禽流感(H9亞型)SD01株攻毒后檢測喉氣管和泄殖腔棉拭子，含VA5免疫增強(qiáng)劑組均未檢測到病毒，而四聯(lián)苗免疫組在攻毒后第5天仍有雞能檢測到病毒。

以上結(jié)果表明，含VA5免疫增強(qiáng)劑的新-支-減-流四聯(lián)疫苗(或新-支-流三聯(lián)疫苗)免疫后比常規(guī)新-支-減-流四聯(lián)疫苗(或新-支-流三聯(lián)疫苗)能夠使機(jī)體提前產(chǎn)生抗體且抗體效價(jià)高從而縮短免疫后保護(hù)空白期，并提高了攻毒保護(hù)率。VA5免疫增強(qiáng)劑不僅能夠提高禽流感單苗、禽用新法二聯(lián)苗和新流二聯(lián)苗的免疫效力，對禽用新-支-減-流四聯(lián)疫苗(或新-支-流三聯(lián)疫苗)也具有同樣的免疫增強(qiáng)作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。