韓小東 張榮志 宋國(guó)琦 李瑋 李玉蓮 張淑娟 高潔 陳明麗 李根英

摘要：小麥抗赤霉病基因中，F(xiàn)hb1基因的抗性最強(qiáng)且最穩(wěn)定。為了解620份小麥品種（系）Fhb1區(qū)段內(nèi)PFT（pore-forming toxin-like）基因不同等位變異的情況及其地理分布規(guī)律，我們采用基因擴(kuò)增和KASP基因分型技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了鑒定。檢測(cè)結(jié)果表明，在這些小麥品種中，共存在3種基因型，即PFT-Ⅰ基因型（GT）、PFT-Ⅱ基因型（AC）和PFT-Ⅲ基因型（null），其頻率分別為10.65%、14.19%和75.16%，即只有約四分之一的小麥品種攜帶PFT基因。PFT-Ⅰ基因型主要分布在國(guó)內(nèi)地方品種以及陜西、江蘇和山東等地的育成品種中；而PFT-Ⅱ基因型則主要分布在河北、河南和山東等地的育成品種中。PFT-Ⅰ是小麥抗赤霉病的必需基因型。因此，這些含PFT-Ⅰ基因型的小麥品種（系）可作為小麥抗赤霉病品種選育的基礎(chǔ)材料。

關(guān)鍵詞：小麥；赤霉??；Fhb1；PFT；KASP標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S512.103.53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）08-0001-06

Allelic Variation Distribution of Fusarium Head Blight Resistance

Gene Fhb1 in Wheat Germplasm

Han Xiaodong， Zhang Rongzhi， Song Guoqi， Li Wei，

Li Yulian， Zhang Shujuan， Gao Jie， Chen Mingli， Li Genying

（Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of

Wheat Biology & Genetic Improvement on North Yellow & Huai River Valley， Ministry of Agriculture/

National Engineering Laboratory for Wheat & Maize， Jinan 250100， China）

Abstract The QTL Fhb1 conferring stable Fusarium head blight（FHB） resistance contributes to the largest effect in wheat. To characterize the allelic variation and geographic distribution of PFT（pore-forming toxin-like） gene in the Fhb1 region of 620 wheat cultivars （lines）， we identified it by PCR amplification and KASP （Kompetitive Allele Specific PCR）. The results showed that there were three genotypes in these wheat varieties， including PFT-Ⅰ（GT）， PFT-Ⅱ（AC）and PFT-Ⅲ（null） genotypes with the frequency of 10.65%， 14.19% and 75.16%， respectively. That was， only about quarter of the tested cultivars carried the PFT gene. Most of the wheat varieties with PFT-Ⅰ genotype were derived from the landraces and breeding cultivars from Shaanxi， Jiangsu and Shandong Province， while the varieties with PFT-Ⅱ genotype were mostly derived from the breeding cultivars of Hebei， Henan and Shandong Province. The PFT-Ⅰ genotype was essential for the FHB resistance in wheat. Thus， these wheat cultivars （lines） with PFT-Ⅰ genotype could be used as the basic materials for wheat breeding with FHB resistance.

Keywords Wheat； Fusarium head blight； Fhb1； PFT； KASP marker

赤霉病嚴(yán)重降低小麥產(chǎn)量、影響谷粒品質(zhì)，其產(chǎn)生的毒素危及人畜、影響食品安全等[1-3]。近幾年來(lái)，我國(guó)小麥赤霉病的發(fā)生區(qū)域有由長(zhǎng)江中下游麥區(qū)和東北麥區(qū)向黃淮海麥區(qū)和北方麥區(qū)逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)[4]。小麥赤霉病抗性分為抗初次侵染（Type Ⅰ）、抗擴(kuò)展（Type Ⅱ）、抗赤霉素積累（Type Ⅲ）、抗籽粒侵染（Type Ⅳ）和抗減產(chǎn)（Type Ⅴ）五大類[5]。每一種抗性類型均受表型加性效應(yīng)和數(shù)量性狀遺傳的多基因調(diào)控[6]。Type Ⅱ型較其他類型穩(wěn)定也易于鑒定[7]，從而成為研究最多的一種類型。

迄今為止，蘇麥3號(hào)是赤霉病抗性最強(qiáng)最穩(wěn)定的抗原之一[8]。在小麥抗赤霉病擴(kuò)展基因中，3BS染色體上的主效QTL Fhb1基因的抗性最強(qiáng)且最穩(wěn)定[9-15]。Rawat等[16]通過(guò)蘇麥3號(hào)3BS染色體上的主效QTL Fhb1的精細(xì)定位，圖位克隆獲得了抗赤霉病擴(kuò)展的基因PFT（pore-forming toxin-like）。PFT基因序列包含3 472個(gè)堿基，2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。其編碼區(qū)含1 437個(gè)堿基，編碼478個(gè)氨基酸，屬于嵌合凝集素類型蛋白。功能上可能與赤霉菌結(jié)合，抑制其生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)抗病。朱展望等[17]對(duì)229份小麥品種Fhb1區(qū)段內(nèi)PFT、HC（HCBT-like defense response protein）和His基因的多樣性與赤霉病抗性的關(guān)系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)整個(gè)PFT基因缺失的小麥材料，即為PFT-Ⅲ基因型（null），如中國(guó)春。在攜帶PFT基因的小麥品種中，有兩個(gè)SNP位點(diǎn)的差異。第一個(gè)SNP（G/A）位點(diǎn)發(fā)生在第2 128位點(diǎn)，此位點(diǎn)的突變會(huì)造成mRNA的錯(cuò)誤剪接。第二個(gè)SNP（T/C）位點(diǎn)，發(fā)生在第2 255位點(diǎn)。兩個(gè)SNP位點(diǎn)為GT基因型的被命名為PFT-Ⅰ基因型，如蘇麥3號(hào)。兩個(gè)SNP位點(diǎn)為AC基因型的被命名為PFT-Ⅱ基因型，如南大2 419。而且只有PFT-Ⅰ/His-Ⅰ為抗赤霉病單倍型。

近幾年來(lái)，KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）基因分型技術(shù)，因其成本低、通量高、精準(zhǔn)度高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[18]，被廣泛用于檢測(cè)SNP分型及Indels位點(diǎn)[19，20]。前人對(duì)Fhb1區(qū)段內(nèi)抗赤霉病基因的研究，主要通過(guò)分子標(biāo)記進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所研究的小麥品種（系）主要來(lái)源于赤霉病多發(fā)的長(zhǎng)江中下游麥區(qū)[17]。本研究結(jié)合基因擴(kuò)增和KASP基因分型技術(shù)，對(duì)620份不同來(lái)源（主要包括黃淮海麥區(qū)和北方冬麥區(qū)）的小麥品種（系）進(jìn)行了抗赤霉病基因型的鑒定，以期為當(dāng)?shù)氐男←湷嗝共】剐愿牧继峁﹨⒖肌?/p>

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于PFT基因型鑒定的國(guó)內(nèi)外小麥品種（系）共計(jì)620份，其中，國(guó)內(nèi)品種（系）547份（含43份地方品種），國(guó)外品種（系）69份，來(lái)源不詳4份。國(guó)內(nèi)品種（系）包括北方冬麥區(qū)：北京33份，寧夏3份，河北38份，陜西34份和山西13份；長(zhǎng)江中下游麥區(qū)：江蘇9份；西南麥區(qū)：四川50份；黃淮海麥區(qū)：安徽19份，河南133份和山東165份；西北麥區(qū)：甘肅1份，新疆1份和青海4份；東北麥區(qū)：黑龍江1份。其中，江蘇省的蘇麥3號(hào)作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2 試劑

2×TSINGKE Master Mix購(gòu)置于青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；2×KASP Master Mix購(gòu)置于LGC集團(tuán)；DNA提取試劑盒購(gòu)置于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 小麥基因組DNA提取

每份試驗(yàn)材料取3粒種子，室溫下發(fā)芽后取其幼嫩葉，參照植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明，提取其基因組DNA。利用NANODROP2000儀器檢測(cè)DNA的濃度以及純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)蘇麥3號(hào)主效QTL Fhb1區(qū)段（GenBank： KX907434.1）內(nèi)PFT基因的序列，通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PFT基因的特異擴(kuò)增引物（青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成）和KASP 標(biāo)記引物（基因集團(tuán)上海貝晶生物技術(shù)有限公司合成），見表1。

1.5 PFT基因的擴(kuò)增

以上述提取獲得的小麥基因組DNA為模板、PFT-F/PFT-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以篩選PFT-Ⅲ和非PFT-Ⅲ基因型的小麥品種。PCR反應(yīng)采用15 μL體系：2×TSINGKE Master Mix 7.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)在Eppendorf系列PCR儀上進(jìn)行，程序如下：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。取8 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)帶型，以確定其基因型。

1.6 KASP反應(yīng)

將用來(lái)鑒定PFT-Ⅰ和PFT-Ⅱ變異類型的KASP引物進(jìn)行混合，共有2組引物，每一組混合引物都由兩條末端標(biāo)簽序列不同的等位基因正向引物（100 μmol·L-1）各12 μL、一條共同的反向引物（100 μmol·L-1）30 μL和46 μL ddH2O組成。PCR反應(yīng)采用5 μL體系：2×KASP Master Mix 2.5 μL，混合引物0.07 μL，DNA（10 ng·μL-1）2.0 μL，ddH2O 0.43 μL?？瞻讓?duì)照（NTC）的DNA模板用ddH2O代替。PCR程序如下：94℃熱激活15 min；94℃變性20 s，61℃退火/延伸60 s，10個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)降低0.7℃）；94℃變性20 s，55℃退火/延伸60 s，26個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后在酶標(biāo)儀Pherastar上讀取熒光數(shù)據(jù)，并通過(guò)SNPviewer軟件生成基因分型圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥基因組DNA提取

用NANODROP2000儀器檢測(cè)出的DNA濃度均在500 ng·μL-1左右，A260/A280的OD值處于1.8～2.0之間?；蚪MDNA電泳結(jié)果如圖1所示，所提DNA條帶清晰無(wú)彌散，可用于下一步試驗(yàn)。

2.2 PFT基因的擴(kuò)增

為了篩選出PFT-Ⅲ和非PFT-Ⅲ基因型的小麥品種，根據(jù)PFT基因的序列設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行了普通PCR擴(kuò)增。通過(guò)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的帶型，結(jié)果如圖2所示：目的條帶為842 bp的為PFT-Ⅰ基因型或PFT-Ⅱ基因型；沒有目的條帶的為PFT-Ⅲ基因型。檢測(cè)結(jié)果顯示，466份小麥材料為PFT-Ⅲ，154份小麥材料為非PFT-Ⅲ。

2.3 小麥品種PFT基因型的KASP檢測(cè)

利用KASP標(biāo)記引物通過(guò)基因分型技術(shù)鑒定PFT-Ⅰ和PFT-Ⅱ基因型的變異類型，結(jié)果如圖3所示。圖中每個(gè)圓點(diǎn)都代表著一個(gè)小麥品種，每組混合引物將154份小麥材料分為兩組，紅色圓點(diǎn)為HEX標(biāo)簽序列，藍(lán)色圓點(diǎn)為FAM標(biāo)簽序列，黑色圓點(diǎn)為空白對(duì)照。圖3A和圖3B為第一個(gè)SNP位點(diǎn)（G/A）的分型結(jié)果，紅色圓點(diǎn)代表PFT-Ⅱ基因型中的A∶A，有88份；藍(lán)色圓點(diǎn)代表PFT-Ⅰ基因型中的G∶G，有66份。圖3C和圖3D為第二個(gè)SNP（T/C）位點(diǎn)的分型結(jié)果，紅色圓點(diǎn)代表PFT-Ⅱ基因型中的C∶C，有88份；藍(lán)色圓點(diǎn)代表PFT-Ⅰ基因型的T∶T，有66份。綜合上述結(jié)果，PFT-Ⅰ基因型（GT型）的小麥品種共66份，PFT-Ⅱ基因型（AC型）的小麥品種共88份，未檢測(cè)到基因型為GC型和AT型的小麥品種。因此，共有66份小麥品種可能具有赤霉病的抗性。

2.4 不同基因型小麥品種資源的區(qū)域分布

參與試驗(yàn)的620份小麥品種（系）中，通過(guò)PFT基因的PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PFT-Ⅲ基因型分布最多，約占所選材料的四分之三，而PFT-Ⅰ、PFT-Ⅱ基因型的分布頻率相當(dāng)，分別為10.65%和14.19%（表2）。如圖4所示，在地方品種（50%以上的為PFT-Ⅰ基因型）、北方冬麥區(qū)的陜西、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)的江蘇和黃淮海冬麥區(qū)的山東和河北等地，含PFT-Ⅰ基因型的小麥品種（系）分布頻率較高；含PFT-Ⅱ基因型的小麥品種（系）則主要分布于北方冬麥區(qū)的河北、黃淮海冬麥區(qū)的河南和山東等地。國(guó)外小麥品種（系）中，大部分屬于PFT-Ⅲ基因型；日本品種（系）中，有2個(gè)屬于PFT-Ⅰ基因型；法國(guó)品種（系）中，有1個(gè)屬于PFT-Ⅰ基因型；意大利品種（系）中，有2個(gè)屬于PFT-Ⅰ基因型。

本研究還利用中國(guó)作物種質(zhì)資源信息網(wǎng)查詢了部分已檢測(cè)出的PFT-Ⅰ基因型小麥品種（系）的赤霉病抗性（表3），發(fā)現(xiàn)PFT-Ⅰ基因型小麥品種（系）中，21份材料表現(xiàn)為感赤霉病，2份材料表現(xiàn)為中感赤霉病，其余抗性未知。

3 討論與結(jié)論

赤霉病表型鑒定受自然環(huán)境以及人的主觀判斷影響很大，不易被準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)。KASP檢測(cè)方法不僅上機(jī)試劑用量少、通量高，而且檢測(cè)精確度很高。本研究通過(guò)基因擴(kuò)增結(jié)合KASP標(biāo)記準(zhǔn)確又快速地鑒定出了620份小麥品種（系）（主要包括黃淮海麥區(qū)和北方冬麥區(qū)）中的PFT基因型。這為當(dāng)?shù)馗牧夹←湷嗝共】剐杂N過(guò)程中的親本選配以及后期高代品系的初篩提供了參考。

620份小麥品種（系）的PFT基因型鑒定結(jié)果表明，PFT-Ⅲ類型為小麥品種（系）的主要基因型（分布頻率為75.16%），這可能是與含有Fhb1區(qū)段的小麥品（種）系的農(nóng)藝性狀差和產(chǎn)量低等不符合現(xiàn)代育種家的要求等因素有關(guān)[17]。中國(guó)作物種質(zhì)資源信息網(wǎng)公布的部分已檢測(cè)出的PFT-Ⅰ基因型小麥品種（系）的赤霉病抗性發(fā)現(xiàn)，某些PFT-Ⅰ基因型小麥品種（系）感赤霉??；而朱展望等[17]對(duì)229份小麥品種（主要包括長(zhǎng)江中下游麥區(qū)）Fhb1區(qū)段內(nèi)PFT、HC和His基因的多樣性與赤霉病抗性的關(guān)系進(jìn)行了分析，其中PFT基因型分為PFT-Ⅰ、PFT-Ⅱ和PFT-Ⅲ三類，His基因型分為His-Ⅰ、His-Ⅱ和His-Ⅲ三類，但是只有PFT-Ⅰ/His-Ⅰ為抗赤霉病單倍型，這說(shuō)明PFT-Ⅰ基因型雖然不能作為篩選抗赤霉病小麥品種（系）的最終標(biāo)準(zhǔn)，但可以作為初步篩選的方法。

本研究結(jié)果顯示PFT-Ⅰ基因型主要分布在中國(guó)北方冬麥區(qū)的河北和陜西、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)的江蘇、黃淮海冬麥區(qū)的山東以及國(guó)外的意大利和日本等地，而且50%以上的地方品種均為PFT-Ⅰ基因型。在國(guó)家農(nóng)業(yè)科學(xué)數(shù)據(jù)共享中心作物科學(xué)數(shù)據(jù)分中心的小麥品種系譜數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)查詢部分已檢測(cè)出的PFT-Ⅰ基因型小麥品種（系）的系譜，發(fā)現(xiàn)PFT-Ⅰ基因型可能來(lái)源有三種，一種是地方品種，比如涇陽(yáng)60、三月黃、洋小麥、白齊麥等；一種是蘇麥3號(hào)或小偃6號(hào)的某一早代親本，比如陜253（77-31/小偃6號(hào)//陜229）；最后一種為美國(guó)碧玉麥，比如石家莊54（螞蚱麥/碧玉麥//早洋麥）、昌樂5號(hào)（濟(jì)南4號(hào)變異株）、濟(jì)南4號(hào)（螞蚱麥/碧玉麥//早洋麥），因?yàn)楸狙芯恳褭z測(cè)螞蚱麥和早洋麥屬于PFT-Ⅲ基因型，而石家莊54為PFT-Ⅰ基因型，所以據(jù)此可推斷PFT-Ⅰ基因型可能確實(shí)來(lái)源于美國(guó)的碧玉麥，這與前人的研究結(jié)果相一致[21-23]。此外，法國(guó)、日本和意大利的小麥品種中也檢測(cè)到PFT-Ⅰ基因型的存在，預(yù)示PFT-Ⅰ基因型可能還有另外的來(lái)源。

總之，在今后的育種工作中，我們可以充分利用含PFT-Ⅰ基因型的小麥地方品種和栽培品種，從中選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良的作為親本，來(lái)進(jìn)行小麥抗赤霉病的品種改良和新種質(zhì)資源的創(chuàng)制。

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