李慶國 劉翠蘭 姚俊修 王因花 王開芳 任飛 燕麗萍 吳德軍

摘要：白蠟是我國一種常見綠化樹種，因緯度位置、海拔高度和海陸分布等自然地理因素不同，造成地區(qū)之間種質(zhì)資源的自然差異。真實性和純度是種質(zhì)資源檢測的重要指標之一，因此建立快速、精準、便捷的 SSR分子標記技術(shù)對于白蠟種質(zhì)的溯源及新品種授權(quán)具有重要意義。本研究以2013年山東省林業(yè)科學(xué)研究院在白蠟種質(zhì)資源調(diào)查項目中采集并保存的38份白蠟為試材，利用SSR分子標記技術(shù)對我國不同緯度地區(qū)的白蠟種質(zhì)資源進行指紋圖譜構(gòu)建，從150對候選引物中成功篩選出15條特異性強、條帶清晰的引物作為核心引物，共檢測出3.8個基因型，每對引物擴增的基因型2～6個不等。并構(gòu)建白蠟DNA指紋圖譜，采用5對引物組合即可將38份白蠟種質(zhì)完全區(qū)分。聚類分析結(jié)果表明，白蠟種質(zhì)間的親緣關(guān)系與緯度因素具有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：白蠟；中低緯度地區(qū)；SSR；DNA 指紋圖譜；遺傳多樣性

中圖分類號：S792.41：Q75 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）08-0019-05

Construction of DNA Fingerprinting and Analysis of

Genetic Diversity with SSR Markers for Fraxinus sp.

in Mid-Latitudes and Low-Latitudes of China

Li Qingguo1， Liu Cuilan1，2，Yao Junxiu1，2， Wang Yinhua1，2，

Wang Kaifang1，2，Ren Fei1，Yan Liping1，2，Wu Dejun1，2

（1. Shandong Academy of Forestry Sciences， Jinan 250014， China；

2. Shandong Provincial Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement， Jinan 250014， China）

Abstract Fraxinus is a kind of common greening tree species in China. Because of the latitude， altitude，sea land distribution and other different natural geographic factors， the natural differences are present between regions and germplasm resources. The authenticity and purity are one of the important indexes for germplasm resource detection. Therefore， it is of great significance to establish a rapid， accurate and convenient DNA molecular marker technique for the traceability of Fraxinus germplasms and the authorization of new varieties. In this study， 38 samples of Fraxinus collected and preserved by Shandong Academy of Forestry Sciences in 2013 were tested. The construction of DNA fingerprinting and analysis of genetic diversity with SSR markers were conducted for Fraxinus in mid-latitudes and low-latitudes. And 15 primers with high specificity and clear bands were selected as core primers from 150 pairs of candidate primers. A total of 3.8 genotypes were detected， and each pair of primers amplified 2～6 genotypes. The Fraxinus could be distinguished by 5 primers. This indicated that there were correlations between phylogenetic relationships and geographic origin of different varieties.

Keywords Fraxinus； Mid-latitudes and low-latitudes； SSR； DNA fingerprinting； Genetic diversity

白蠟由于其耐鹽性極強、觀賞價值高和分布范圍廣等特點，被國內(nèi)許多省市廣泛引種栽培，是目前應(yīng)用最廣泛的綠化樹種之一[1]。國內(nèi)對白蠟育種的研究起步比較早，但多限于對絨毛白蠟的變異觀測和人工林栽培選擇育種方面，且未廣泛采用生物技術(shù)等新興技術(shù)開展研究，致使白蠟遺傳育種方面的研究遲滯不前，培育出的優(yōu)良品種很少[2，3]，在一定程度上造成白蠟種質(zhì)資源的浪費；同時，現(xiàn)有白蠟種間鑒別不清的問題也普遍存在[4]，白蠟種內(nèi)的變異類型沒有一致的劃分標準，分類不明晰，缺少白蠟種質(zhì)基因庫以及種質(zhì)資源保護、評價、推廣和利用的綜合體系建設(shè)[5]。由于形態(tài)鑒定的時效性差，極易受到環(huán)境與主觀因素的影響，使得依據(jù)形態(tài)性狀進行品種田間檢驗的難度越來越大[6]，品種多、雜、亂的現(xiàn)象難以得到有效控制。

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，采用分子標記鑒別植物品種得到廣泛應(yīng)用。SSR分子標記具有快速簡單、自動化等優(yōu)點，基于此的DNA 指紋圖譜鑒定技術(shù)精準、可靠，不受季節(jié)和環(huán)境的影響，是品種鑒定的最主要分子標記技術(shù)之一[7]。國際植物新品種權(quán)保護聯(lián)盟（UPOV）在分子標記測試指南中即采用SSR和SNP標記方法構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫，其中SSR標記價廉、技術(shù)成熟，是目前植物基因組建庫的首選標記[8]。近年來，科研人員已基于SSR標記構(gòu)建了玉米[9]、甜瓜[10]、中國櫻桃[11]、杏[12]、杜仲[13]等的基因組DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。在白蠟樹種分子標記研究方面，王健兵等[14]利用正交設(shè)計試驗優(yōu)化了白蠟SSR反應(yīng)體系，篩選出多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)率均較高的SSR引物標記，為白蠟種質(zhì)SSR分子標記的鑒定奠定了基礎(chǔ)；胡春龍[15]采用SSR標記方法，對白蠟種質(zhì)資源分子身份證及遺傳多樣性進行了研究。但關(guān)于中國不同緯度地區(qū)的白蠟種質(zhì)開展DNA指紋圖譜構(gòu)建及應(yīng)用的研究還未見報道。本研究采用SSR標記對2013年收集的中國不同緯度地區(qū)部分白蠟種質(zhì)進行DNA指紋圖譜構(gòu)建，并進行遺傳多樣性分析，對白蠟品種鑒別、種質(zhì)資源管理、雜交育種、知識產(chǎn)權(quán)保護和苗木質(zhì)量提高均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗所用的38份白蠟試材為2013年山東省林業(yè)科學(xué)研究院白蠟種質(zhì)資源調(diào)查項目組采自黑龍江、新疆、北京、甘肅、山東、陜西和湖南6個省市，均為當?shù)貥潺g長且具有干形直、綠期長等優(yōu)良特性的白蠟種質(zhì)（表1）。

1.2 DNA的提取及檢測

按照均勻分布、隨機采集的原則取白蠟試材的新鮮葉片并置于-50℃保存，采用改進 CTAB法提取基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，帶型清晰（圖1），符合實驗要求。

1—13分別指白蠟1號—白蠟13號。

圖1 白蠟基因組DNA檢測

1.3 引物篩選和PCR擴增

選取田間表型性狀差異較大的4份白蠟種質(zhì)提取DNA進行SSR引物篩選，所用引物由山東省林業(yè)科學(xué)研究院通過轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)，初步選出150對SSR引物作為本研究的候選引物，由山東沃恩科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，5～10 ng/μL DNA模板0.2 μL，10 ng/μL PCR-Mix 5.5 μL，ddH2O 3.7 μL，共計10 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，54～58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃ 10 min終止反應(yīng)。擴增產(chǎn)物進行8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測：擴增產(chǎn)物點樣3.5 μL，分子量標準為50 bp DNA Ladder，在200 V 電壓下預(yù)電泳30 min，之后電泳2 h，在0.1%的AgNO3 溶液中銀染，漂洗，NaOH 溶液中顯色[16]，凝膠掃描保存，統(tǒng)計數(shù)據(jù)后進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)SSR擴增目標產(chǎn)物在電泳凝膠上的大小和重復(fù)單元，每對引物產(chǎn)生的不同帶型，建立其DNA分子指紋圖譜。利用NTSYS-pc V 2.10軟件，將數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換為軟件計算格式，采用Popgene 32軟件計算I值（Shannons information index）和H值（Neis gene diverity），多態(tài)信息含量PIC值 （polymorphism information content）參考Nei的方法進行計算[17]。采用最短距離法得出PUGMA親緣關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性分析

用150對引物（Y1～Y150）對4份白蠟種質(zhì)進行擴增，初步篩選出15對特異性強、穩(wěn)定性好的多態(tài)性引物，15對引物對38份白蠟材料的擴增結(jié)果見表2，共擴增出57個多態(tài)性位點，每對引物的多態(tài)性位點2～6個不等，平均每對引物擴增出3.8個多態(tài)性位點。不同位點的PIC值變化范圍為0.625 1～0.917 1，平均PIC值為0.807 7；I值最大為0.921 4，平均值為0.757 3；H值平均為0.777 9。一般認為PIC>0.50時為高度多態(tài)性信息引物，當0.25

2.2 品種指紋圖譜分析

利用篩選的15對引物對38份白蠟種質(zhì)進行指紋分析，僅用1個特征引物Y132就可將白蠟7號、白蠟10號、白蠟13號、白蠟14號、白蠟15號、白蠟18號、白蠟23號、白蠟26號、白蠟32號、白蠟34號共計10份種質(zhì)與其它種質(zhì)區(qū)分開。白蠟1號、白蠟3號和白蠟4號具有5個特征引物，白蠟2號、白蠟5號、白蠟9號、白蠟11號、白蠟20號和白蠟21號具有2個特征引物，白蠟25號具有3個特征引物。引物Y78、Y132在36份白蠟種質(zhì)上均表現(xiàn)出特征譜帶，說明這兩個引物多態(tài)性豐富，特征譜帶穩(wěn)定，在進行白蠟種質(zhì)指紋鑒定時可優(yōu)先采用。

從15 對引物中挑選多態(tài)性相對豐富的Y78、Y132和Y149引物進行組合鑒別，可以鑒別26份種質(zhì)。Y55、Y78、Y132和Y149引物組合可鑒別34份種質(zhì)，白蠟1號、白蠟5號、白蠟6號、白蠟12號4個種質(zhì)無法區(qū)分，而引物Y39在這4份白蠟種質(zhì)中顯現(xiàn)出4種不同基因型，因此，采用Y39、Y55、Y78、Y132和Y149組合可將來自不同緯度地區(qū)的38份白蠟種質(zhì)完全區(qū)分開。

2.3 不同來源地?zé)o性系之間的親緣關(guān)系

利用SSR標記對38份白蠟種質(zhì)進行聚類分析，結(jié)果見圖2?？梢钥闯觯?.63的聚類水平上，可以將38份種質(zhì)分為兩個大類。第一大類只有一份種質(zhì)白蠟18號，是課題組從湖南省引進的種質(zhì)資源。第二大類包括37份種質(zhì)，在0.43的聚類水平上，可劃分為兩個亞類，第一亞類包括白蠟2號、白蠟4號、白蠟8號、白蠟10號、白蠟12號、白蠟14號、白蠟22號、白蠟24號、白蠟26號、白蠟30號、白蠟32號、白蠟36號共12個種質(zhì)，其中5個種質(zhì)來自黑龍江，4個種質(zhì)來自北京，3個種質(zhì)來自新疆；第二亞類包括白蠟1號、白蠟3號、白蠟5號、白蠟6號、白蠟7號、白蠟9號、白蠟11號、白蠟13號、白蠟15號、白蠟16號、白蠟17號、白蠟19號、白蠟20號、白蠟21號、白蠟23號、白蠟25號、白蠟27號、白蠟28號、白蠟29號、白蠟31號、白蠟33號、白蠟34號、白蠟35號、白蠟37號、白蠟38號共25個種質(zhì)，其中11個種質(zhì)來自陜西，9個來自山東，4個來自甘肅，1個來自北京。SSR分子標記的聚類結(jié)果與種質(zhì)的緯度空間分布具有一定的相關(guān)性?？梢?，SSR分子標記在一定程度上反映了種質(zhì)的地理分布特點。

3 討論與結(jié)論

解決白蠟育種和種質(zhì)資源管理方面的問題，研究其物種的遺傳多樣性和種質(zhì)間的親緣關(guān)系具有非常重要的意義[19]。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測SSR技術(shù)對白蠟種質(zhì)SSR反應(yīng)體系進行優(yōu)化和遺傳多樣性分析，前人已有研究報道，其結(jié)果為平均每對引物檢測到3.5個多態(tài)位點，多態(tài)性信息含量（PIC）平均為0.548 0[14，15]。本研究遴選了15對多態(tài)性引物對38份白蠟屬植物進行遺傳多樣性分析，所有引物均表現(xiàn)出了多態(tài)性，每對引物的多態(tài)性位點2～6個不等，平均每對引物擴增出3.8個多態(tài)性位點；不同位點的PIC值變化范圍為0.625 1～0.917 1，平均PIC值為0.807 7，這一結(jié)果高于前人的研究結(jié)果，可能與所選用的38份白蠟種質(zhì)來自中國的中、低緯度不同地區(qū)有關(guān)。黎中寶等[20]曾對不同緯度地區(qū)的桐花樹進行遺傳多樣性研究，得出的結(jié)論為桐花樹的親緣關(guān)系與地理因素具有一定的相關(guān)性。

目前很多國家在林木新品種審定時都需要DUS證明，用于區(qū)分新品種與已知品種的不同[21，22]。近年來SSR分子標記技術(shù)由于具有簡單、重復(fù)性好、共顯性的特點得到廣泛運用。本試驗采用SSR技術(shù)構(gòu)建了中國不同緯度地區(qū)38份白蠟種質(zhì)的DNA指紋圖譜，從15對SSR引物中篩選出5對Y39、Y55、Y78、Y132和Y149組合可將來自不同緯度地區(qū)的38份白蠟種質(zhì)完全區(qū)分開。隨著白蠟新品種的不斷推出，品種的指紋圖譜還需要不斷加強，這就需要研究者不斷篩選出新的核心引物，為今后新的品種盡可能提供指紋認證，只有如此，才可能更好地構(gòu)建種質(zhì)資源保護、評價、推廣、利用的綜合體系建設(shè)[18，23]。

本研究聚類分析結(jié)果顯示，以緯度為分類可將所有種質(zhì)分為2大類，來自低緯度湖南的聚為一類，而來自新疆、黑龍江、甘肅、陜西、北京、山東中緯度地區(qū)的白蠟種質(zhì)聚為一類，說明緯度因素對種質(zhì)有很大影響，即種質(zhì)間的親緣關(guān)系與地理來源有一定的相關(guān)性。來源緯度相近的黑龍江5個、北京4個、新疆3個種質(zhì)聚為一類；來源緯度相近的陜西11個、山東9個、甘肅4個、北京1個種質(zhì)聚為一類。可以看出大部分地理來源相同的種質(zhì)聚在了同一類群中，但也有少部分不同地理來源的種質(zhì)聚在同一類群，這可能是由于不同生態(tài)環(huán)境下種質(zhì)資源的基因交流，導(dǎo)致不同生境條件下的種質(zhì)資源的親緣關(guān)系發(fā)生了變化[24-26]。不同種植區(qū)的生態(tài)環(huán)境變化和地區(qū)間產(chǎn)生的基因交流也有利于其遺傳變異的積累和保持。

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