馮 錦 初雯雯端肖楠 胡德夫吳洪潘 葛 炎初紅軍*

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊，830046；2.新疆卡拉麥里山有蹄類野生動物自然保護區(qū)管理中心，烏魯木齊，830000；3.北京林業(yè)大學自然保護區(qū)學院，北京，100083)

蒙古野驢(Equushemionus)屬奇蹄目(Perissodactyla)、馬科(Equidae)、馬屬[1]，是亞洲荒漠及荒漠草原的代表性物種，屬于國家I級重點保護野生動物，被列入瀕危野生動植物種國際貿易公約(CITES)附錄I[2]。曾廣泛分布于我國甘肅、青海、新疆及內蒙古等地[3]，目前分布局限在新疆卡拉麥里山有蹄類自然保護區(qū)(以下簡稱卡山保護區(qū))與內蒙古烏拉特梭梭林蒙古野驢自然保護區(qū)內[2]。

國內對于蒙古野驢的研究主要集中在數量與分布[2，4-7]、行為[8-9]、食性[10-13]、生態(tài)和種群結構[14]、種群交流[15]等方面，其遺傳多樣性研究沒有開展。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)是細胞質遺傳的物質基礎，與細胞核DNA相比，具有分子結構簡單、無重組、進化速率快和嚴格遵循母系遺傳等特點[16]。線粒體DNA控制區(qū)(以下簡稱D-loop區(qū))又稱為替代環(huán)區(qū)(displacement-loop region)或D環(huán)，是線粒體中堿基序列和長度變異最大的區(qū)域，進化速率是其他區(qū)段的5倍[17-18]，具有堿基替換速率快、存在豐富的序列變異等特點，特別適合于檢測種群內及種群間的遺傳多樣性[19-21]。

我們利用線粒體D-loop區(qū)對卡山保護區(qū)蒙古野驢的遺傳多樣性進行了研究，在此基礎上分析了卡山保護區(qū)蒙古野驢種群瀕危的可能原因和機制，從分子遺傳學角度為蒙古野驢種群有效保護和遺傳管理方案的制定提供了科學參考依據。

1 研究方法

1.1 研究區(qū)概況與樣品采集

卡山保護區(qū)地處新疆準噶爾盆地古爾班通古特沙漠東緣，地理坐標為N44°36′～46°00′，E88°30′～90°03′，海拔高度800～1467 m，屬低山荒漠、半荒漠景觀。在氣候上屬中溫帶大陸性氣候，其特點是冬季寒冷漫長、秋季溫涼、夏季炎熱短暫、春季干旱少雨?？ㄉ奖Ｗo區(qū)植被稀疏，野生動物以適應干旱和半干旱的種類占優(yōu)勢，大中型有蹄類動物和小型嚙齒動物是卡山保護區(qū)的代表性物種，主要有蒙古野驢、野放普氏野馬(Equusprzewalskii)、盤羊(Ovisammon)、鵝喉羚(Gazellasubgutturosa)、猞猁(Lynxlynx)等[22]。

2013～2015年間，對卡山保護區(qū)進行日常野外監(jiān)測時發(fā)現的蒙古野驢尸體進行采樣，最終所得樣品共30份，其中皮張11份，肌肉組織19份。在采集過程中，對樣本信息進行詳細記錄，采集之后立即放入-20℃冰箱儲存。

圖1 卡拉麥里有蹄類自然保護區(qū)蒙古野驢采樣點Fig.1 Equus hemionus sampling points in the MKUNR of Xinjiang

1.2 DNA提取、PCR擴增與測序

蒙古野驢皮張和肌肉組織mtDNA通過細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術有限公司)提取。根據GenBank檢索的藏野驢mtDNA全序列[23]，蒙古野驢mtDNA D-loop區(qū)引物通過Primer軟件進行設計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

上游引物：

5′-CTTGTAAACCAGGAAAGGGGGAAAC-3′；

下游引物：

5′-ATTTAGAGGGCATTCTCACTGGGAT-3′。

PCR反應體系25 μL，其中2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增過程：94℃預變性3 min，94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，取擴增效果良好的樣品20 μL，由北京六合華大基因科技有限公司進行雙向測序。

1.3 數據分析

用DNAStar 5.0軟件對所測序列進行拼接、比對并進行人工校對；運用MEGA 6.0軟件的Clustal X 1.81進行多序列同源比對，統(tǒng)計堿基組成、轉換、顛換和單倍型間Kimura參數模型的遺傳距離，基于Kimura雙參數距離分別用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)等方法構建種內聚類關系；DnaSP 5.10軟件進行多態(tài)位點、單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析；Network 5.0軟件構建單倍型網絡關系圖；并用 Analysis 模塊進行Tajima’s D中性檢驗。

2 結果與分析

2.1 序列長度與堿基組成

卡山保護區(qū)采集的30個蒙古野驢樣本中4個樣本因保存不當或材料消耗而缺失。成功擴增并測序了26個mtDNA D-loop區(qū)848 bp的序列，T、C、A、G 等4種核苷酸的平均比例分別為25.9%(25.1%～26.3%)、30.0%(25.4%～31.0%)、27.4%(26.5%～29.2%)、16.7%(16.1%～18.6%)，A+T含量53.3%，G+C含量46.7%，表明蒙古野驢mtDNA D-loop區(qū)富含堿基A+T，表現出一定的堿基偏好性。

2.2 序列的核苷酸多態(tài)性

全序列共有保守位點601個，變異位點247個，其中單一多態(tài)位點178 個，占多態(tài)位點總數的72.1 %，簡約信息位點69個，占多態(tài)位點總數的 27.9 %。序列變異中堿基缺失、插入和堿基替換等均有，其中堿基替換變異類型中轉換195次，顛換46次，在轉換變異類型中以A/G為主，占52.2%，在顛換變異類型中以A/T為主，占60 %。蒙古野驢 mtDNA D-loop區(qū)核苷酸多樣性(π)為(0.2039±0.0523)。對測定的序列進行Tajima’s D值中性檢驗，Tajima’ s D值為負值但不顯著(D=-0.722；P>0.10)，表明這些序列符合中性進化模式，蒙古野驢在整體水平上并未出現過瓶頸效應或者快速擴張等歷史事件。

2.3 序列的單倍型分布

根據蒙古野驢mtDNA D-loop區(qū)序列247個變異位點，在26個樣品中鑒定出23種單倍型(H1-H23)，其中H3包含4條，其他22種單倍型都只包含1條序列，單倍型多樣性(Hd)為(0.982±0.020)，表明蒙古野驢具有豐富的單倍型類型。

2.4 種內系統(tǒng)發(fā)育分析

蒙古野驢23個單倍型間的 Kimura 雙參數遺傳距離變異范圍為 0.001～1.846，平均遺傳距離是0.435(表1)?；贙imura 雙參數距離采用NJ、ML法對蒙古野驢的D-loop區(qū)23個單倍型的發(fā)育樹顯示相同的拓撲結構(圖2，圖3)，都顯示2個主要分支。結合單倍型遺傳距離可看出：A包括3種單倍型(H4，H10，H15)共3個個體，占全部單倍型的13%；分支B包括余下的20種單倍型共23個個體，占全部單倍型的87% 。

表1 蒙古野驢23個單倍型間 Kimura 雙參數遺傳距離

Tab.1 Equus hemionus 23 haplotype Kimura two-parameter genetic distance

圖2 蒙古野驢mtDNA D-loop區(qū)23個單倍型NJ發(fā)生樹Fig.2 Equus hemionus mtDNA D-loop region 23 haplotypes NJ tree

圖3 蒙古野驢mtDNA D-loop區(qū)23個單倍型ML發(fā)生樹Fig.3 Equus hemionus mtDNA D-loop region 23 haplotype ML tree

根據蒙古野驢 mtDNA D-loop區(qū)單倍型序列的變異位點，運用 Network 5.0 軟件得出蒙古野驢單倍型網絡關系圖(圖4)。發(fā)現23種單倍型根據演化距離滿足拓撲結構分為的2個主要分支，其中單倍型H4，H10，H15相較于其他單倍型親緣距離較遠。再結合圖2所示，H4、H10、H15先與H14聚在一起，然后再與H9聚在一起；而圖3所示，H4、H10、H15先與H14聚在一起，然后再與H12聚在一起。從單倍型遺傳距離中也可看出，分支A與分支B之間相比于同支內單倍型之間關系較遠。

圖4 蒙古野驢mtDNA D-loop區(qū)23個單倍型網絡關系圖Fig.4 Equus hemionus mtDNA D-loop region 23haplotypes network diagram

2.5 與其他野生馬科動物的親緣關系

將蒙古野驢序列和馬科中的其他7個物種D-loop區(qū)基因序列進行比較，利用GenBank檢索的其他馬科野生動物的同源序列，以奇蹄目貘科(Tapiridae)的馬來貘(Tapirusindicus)為外群，基于Kimura雙參數距離應用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)構建馬科D-loop區(qū)基因分子系統(tǒng)進化樹(圖5，圖6)，進化樹各分支上的數值表示1000次自舉(bootstrap)檢測得出對該分支的支持百分數。兩種不同的分子系統(tǒng)進化樹得到的結果相同。通過ML法得到進化樹的拓撲結構中，平原斑馬(Equusquagga)、山斑馬(Equuszebra)和努比亞野驢(Equusasinusafricanus)形成了一個進化枝，置信度較低為32%。蒙古野驢先與藏野驢(Equuskiang)聚在一起，置信度為97%。后與細紋斑馬(Equusgrevyi)三者形成一個進化枝。然后兩個進化枝聚集在一起形成一支，置信度為56%。最后再與普氏野馬、非洲野馬(Equusferus)形成一支。馬科動物內8個物種中，蒙古野驢與藏野驢的親緣關系最近，普氏野馬與非洲野馬親緣關系最近。馬科動物中平原斑馬、山斑馬、努比亞野驢、蒙古野驢和藏野驢出現較早，其中最早出現的物種是平原斑馬。

圖5 基于D-loop基因序列構建的馬科物種的最大似然法(ML)進化樹(圖中數字為自引導值)Fig.5 Maximum likelihood method(ML)evolutionary tree basedon the D-loop gene sequence constructed from equine species(The numbers in the figure are self-directed values)

圖6 基于D-loop基因序列構建的馬科物種的鄰接法(NJ)進化樹(圖中數字為自引導值)Fig.6 Adjacent(NJ)phylogenetic tree based on the D-loop genesequence (The numbers in the figure are self-directed values)

3 討論

3.1 蒙古野驢mtDNA D-loop區(qū)的遺傳多樣性

本實驗采用測序法，測定的26匹蒙古野驢mtDNA D-loop區(qū)848 bp的序列中，有247個變異位點，占所測核苷酸數的29.03%，序列變異中堿基缺失、插入、替換、顛換等均存在。而3個克羅地亞驢群體28匹的mtDNA D-loop區(qū)391 bp序列進行分析，共檢測到36個核苷酸多態(tài)位點，約占所測核苷酸數的9.21%，其中有轉換、顛換、插入位點3種類型[17]。蒙古野驢mtDNA D-loop區(qū)序列核苷酸相比克羅地亞驢突變率較高。同時我們檢測的247個核苷酸多態(tài)位點中，轉換195次，顛換46次，具有較強的偏向性，與mtDNA進化過程中堿基變異發(fā)生轉換頻率高于顛換的結果相同。

通過對卡山保護區(qū)蒙古野驢線粒體DNA D-loop區(qū)基因的測定及分析，得出核苷酸多樣性(π=0.2039±0.0523)大于通過D-loop基因與Cytb基因研究[16]的蒙古野馬、家馬、驢核苷酸多樣性(π=0.00925/0.01022)，也大于王小斌等[24]研究的蒙古馬核苷酸多樣度(π=0.02756±0.00967)及阿地力江·卡德爾[25]研究新疆吉木薩爾繁殖中心的普氏野馬核苷酸多樣性(π=0.029)。其單倍型多樣性(Hd=0.982±0.020)，與海棠等[16]分別通過D-loop基因與Cytb基因研究的蒙古野馬、家馬、驢單倍型多樣性(Hd=0.9356/0.400～1.000)結果大致相等，與王小斌等[24]研究蒙古馬單倍型多樣性(Hd=0.979±0.007)大致相等，也略小于阿地力江·卡德爾[25]研究新疆吉木薩爾繁殖中心的普氏野馬單倍型多樣性(Hd=1±0.00116)。說明本區(qū)域蒙古野驢比其他馬科動物核苷酸多樣性較高，而單倍型多樣性大致相同。Khaire 等[26]利用微衛(wèi)星標記研究印度野驢遺傳多樣性時，得出遺傳多樣性低的結果與我們結果不同。Nasiri-Moghadam等[27]采用微衛(wèi)星標記研究波斯野驢種群遺傳結構時發(fā)現人為因素是導致這種瀕危亞種種群數量減少的主要原因，但對過去近百年野驢種群規(guī)模變化的評估中并未顯示出突然減少，且種群遺傳多樣性較為穩(wěn)定。我們與波斯野驢研究結果相同的是歷史上蒙古野驢也曾廣泛分布在蒙古高原的中西部、亞洲中部、印度次大陸和西南亞地區(qū)，即使近代文明興起短期內導致其分布區(qū)和種群數量減少，但仍然保留了蒙古野驢豐富的遺傳多樣性。中性檢驗也證明蒙古野驢種群在過去并未發(fā)生過明顯的瓶頸效應或進行快速的擴張，而是處在種群的被動平衡狀態(tài)。

采用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)構建蒙古野驢mtDNA D-loop區(qū)23種單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹，拓撲結構均分為較為明顯的兩支。蒙古野驢單倍體間遺傳距離(表1)數值差異表現23個單倍體中有3個特殊單倍體H4、H15、H10，系統(tǒng)發(fā)育樹得到的結果一致。由于線粒體DNA具有嚴格的母系遺傳及單倍體遺傳的特性，因此相同母系個體擁有相同的單倍型[28]。由此推斷，這兩支蒙古野驢可能來源于具有一定遺傳差異的群體，而不是少數幾個關系非常近的母體。Feh等[14]利用景觀生態(tài)學研究蒙古戈壁蒙古野驢生態(tài)和種群結構中提出由于戈壁公園野驢有向西或者向中國北部遷徙可能。Kaczensky等[15]利用歷史記載、當前分布范圍、群體遺傳學及遙測數據等評估了蒙古戈壁蒙古野驢種群在自然景觀、人為景觀和現有保護網絡通道區(qū)域的連通性，將卡山保護區(qū)與蒙古國戈壁保護區(qū)稱為“跨界生態(tài)走廊”，兩國邊界某些圍欄打開將擴大或重新連接蒙古野驢及其他哺乳動物種群之間的交流?？ㄉ奖Ｗo區(qū)位于準噶爾盆地東部，歷史上記載及地理遙感信息顯示在阿爾泰山以東蒙古戈壁國家公園與卡山保護區(qū)交界處并不存在較大的地理隔離，地理空間的連通性及系統(tǒng)進化樹分析讓我們猜測蒙古野驢種群有外來遷入可能。由Network中可以看到，所有單倍型起源于假想單倍型mv1，但mv1所在B支分離出去的分支中也在進化過程中出現分歧，因此符合我們對卡山保護區(qū)蒙古野驢外來遷入的猜測。

3.2 馬科內系統(tǒng)發(fā)育地位

本研究將所得蒙古野驢D-loop區(qū)序列和利用GenBank檢索的其他馬科其他7個物種同源序列進行比較，發(fā)現蒙古野驢與藏野驢親緣關系最近，而同區(qū)域生存的普氏野馬與非洲野馬親緣關系最近。雖然國內尚未在分子水平上對蒙古野驢進行系統(tǒng)研究，以往學者[29-30]認為蒙古野驢和藏野驢只達到亞種的分化水平，現在則認為它們是親緣關系很近的不同種[31-33]。藏野驢過去被認為是亞洲野驢的一個亞種[34]，Ryder和Chemnick[35]通過比較二者的染色體和線粒體DNA證明二者并非同一物種，但證明了蒙古野驢與西藏野驢之間親緣關系最近。Steiner等[36]和Vilstrup等[37]通過單倍型分析研究發(fā)現，藏野驢是亞洲野驢經過單倍體較大變異而形成的分支。Rosenbom等[38]在對亞洲野驢建立系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現，亞種野驢被確定為蒙古野驢和藏野驢兩分支，這些分支沒有進一步分化。Khaire等[39]在研究印度野驢進化過程中通過Cytb和D環(huán)構建馬科動物系統(tǒng)發(fā)育樹中，藏野驢與蒙古野驢關系最近，這與我們研究結果相同。Orlando等[40]通過非洲野驢化石與蒙古野驢和藏野驢進行形態(tài)學比較發(fā)現三者較相近，從中提取了線粒體Cytb基因和D-loop基因。在Genbank中下載馬科動物Cytb基因進行比較發(fā)現非洲野驢與蒙古野驢遺傳距離最小，比較D-loop基因發(fā)現非洲野驢只與蒙古野驢和藏野驢在mtDNA CR中存在共享缺失，構建系統(tǒng)進化樹得出藏野驢與蒙古野驢關系最近的結果與我們相同。另外，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示平原斑馬最早出現，山斑馬首先分裂，然后是蒙古野驢、藏野驢、努比亞野驢，然后是細紋斑馬，最后是普氏野馬與非洲野馬。Jansen等[41]在利用馬科動物mtDNA D-loop區(qū)等序列構建系統(tǒng)發(fā)育網絡圖發(fā)現馬科動物分化先后順序與我們的結果相同。Mashima[42]在對普氏野馬和家馬在內的4種馬科動物研究中，利用mtDNA構建馬科系統(tǒng)發(fā)生樹得出普氏野馬是由家馬演化出來的，對于馬科其他動物演化順序與本研究大致相同。Orlando等[43]在對多種馬科動物標本形態(tài)學與mtDNA基因比較后提出，將海角斑馬、平原斑馬、蒙古野驢及非洲野驢等歸為一個物種，這在現代學分類上與我們結果不同，但在我們得出馬科動物前期演化順序基礎上可將幾者視為一大類。

通過分子上研究發(fā)現，開展卡山保護區(qū)蒙古野驢的遺傳多樣性研究尤為重要。在保護蒙古野驢多樣性以及種群穩(wěn)定前提下，應對卡山保護區(qū)進行合理規(guī)劃，避免擠占蒙古野驢等野生動物的生存空間。另外，通過卡山保護區(qū)廣大地理面積與豐富的野生動植物資源，增加保護和管理力度，保持物種繁育潛力和努力保存蒙古野驢存在最大種群數量，抵消近幾十年人為因素導致蒙古野驢棲息地驟減、過度捕獵及偷獵造成數量減少的嚴重損失。

目前，對于卡山保護區(qū)蒙古野驢遺傳多樣性的研究僅限于mtDNA D-loop 區(qū)，條件具備時利用mtDNA Cytb、核DNA、Y染色體以及全基因組測序，對其進行遺傳多樣性、遺傳分化以及發(fā)育地位等方面的研究。

致謝：本研究得到科技部科技基礎性工作專項重大項目(2013FY110300)，卡拉麥里山有蹄類自然保護區(qū)阿勒泰管理站中央財政森林生態(tài)效益補償基金項目，新疆自治區(qū)科技支撐計劃項目(201233131)的資助。卡山保護區(qū)阿管站蔣新春、蒙坎、李斌、白碩、艾代、蔣鋒、阿爾成、葉爾江、木合買提、哈力和木合牙提等同志參加野外標本等數據收集工作；新疆大學資環(huán)學院碩士研究生王淵、劉元超、新疆大學生命學院碩士研究生杜聰聰以及新疆農業(yè)大學動科學院碩士研究生董潭成等同學參加數據收集工作；新疆卡拉麥里山有蹄類野生動物自然保護區(qū)阿勒泰管理站哈孜拜副站長、布蘭科長、梁興凱科長等同志在工作和生活上給予大力支持和幫助；新疆大學張富春教授、馬紀教授、孫素榮教授和馬哈木提教授等提供實驗室并給予熱情指導和幫助；新疆大學生命學院碩士研究生杜聰聰同學給予實驗技術指導和幫助，謹致衷心感謝。