改良抗酸染色法對(duì)泌尿系結(jié)核的臨床診斷價(jià)值

袁洋 劉月英 李?yuàn)檴?肖璠 陳南山 陳華

（1.西藏山南市乃東區(qū)人民醫(yī)院，西藏 山南 856100；2.武漢市金銀潭醫(yī)院，湖北 武漢 430023）

結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis，MTB）是抗酸桿菌（acid-fast bacilli）的一種類型。結(jié)核菌可侵犯全身各組織器官引起結(jié)核病。結(jié)核病是單一病原菌引起的感染性疾病中死亡率最高的疾病之一，是人類面臨的重大公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題，中國(guó)約有50%的人感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌。近年來(lái)，由于艾滋病發(fā)病率的不斷攀升、免疫抑制劑等藥物的大范圍使用和耐多藥菌株增多等原因，結(jié)核病的發(fā)生率正不斷回升［22］，除了常見(jiàn)的肺結(jié)核、漿膜腔結(jié)核、骨關(guān)節(jié)結(jié)核、消化道結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病之外，原本發(fā)病率很低的泌尿系統(tǒng)結(jié)核病也呈不斷增多趨勢(shì)。根據(jù)報(bào)導(dǎo)，現(xiàn)在全世界每年有將近1000萬(wàn)人感染各類結(jié)核病，其中泌尿系結(jié)核（腎結(jié)核、輸尿管結(jié)核、膀胱結(jié)核等）大約占到8-20%.本病早期癥狀不典型易被誤診為慢性尿路感染，常常被使用氟喹諾酮類抗生素反復(fù)抗感染治療。由于氟喹諾酮類抗生素有殺滅部分結(jié)核分枝桿菌的作用，所以前期的治療往往有一定療效，但由于反復(fù)單用氟喹諾酮類藥物短期抗結(jié)核治療，很容易引起耐藥結(jié)核菌株的集中繁殖導(dǎo)致耐藥結(jié)核病，故對(duì)后期結(jié)核病的治療帶來(lái)了很大困難［13］。而泌尿系結(jié)核病往往被發(fā)現(xiàn)時(shí)，病變已侵犯到雙側(cè)，腎功能已經(jīng)嚴(yán)重受損，故對(duì)人們的身體健康危害極大，嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量，而且治愈率低。因此早期診斷對(duì)治療尤為重要。在眾多輔助檢查中，病理診斷作為確診的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”占有重要地位，但該方法多通過(guò)創(chuàng)傷性檢查完成，患者依從性差，診斷的敏感性和陽(yáng)性率較低，操作耗時(shí)費(fèi)力，故臨床上不作為診斷的首選方式。血清學(xué)方法比較方便，但是缺乏敏感性和特異性，往往作為輔助診斷。PPD試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不易區(qū)分是否卡介苗接種、MTB潛伏感染及NTM感染。近年來(lái)，DNA技術(shù)以及其他快速培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使得檢測(cè)結(jié)核桿菌的時(shí)間大大縮短，但由于價(jià)格昂貴，尚未能在臨床廣泛推廣使用。實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查具有較高的特異性，且操作簡(jiǎn)便，患者無(wú)痛苦。傳統(tǒng)的抗酸染色法（Ziehl–Neelsen染色法）對(duì)結(jié)核桿菌只有3-5%的檢出率，且準(zhǔn)確度低。MTB培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性率只有25-37%，培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)，一般在4-8周，雖然現(xiàn)在有先進(jìn)的BD液體快速培養(yǎng)技術(shù)，但是也往往需要2-3周才會(huì)觀察到結(jié)核桿菌生長(zhǎng)［18］，這樣往往會(huì)耽誤病情診斷及后續(xù)治療，導(dǎo)致病情進(jìn)展。近幾年，應(yīng)用玻片離心沉淀儀的改良抗酸染色技術(shù)大大提高了結(jié)核性腦膜炎的診斷效率，其原理為首先應(yīng)用玻片離心沉淀儀濃縮腦脊液中的細(xì)胞和分枝桿菌，然后進(jìn)行固定細(xì)胞和破壞細(xì)胞膜蛋白，再行抗酸染色。由于其濃縮原理較離心沉淀法好，避免了菌的浮力和轉(zhuǎn)移損失的問(wèn)題，加之收集的菌沉淀面積小，染色后可以同時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)外的分枝桿菌，所以陽(yáng)性率較離心涂片法提高了將近80%［3］.因此，我們推測(cè)改良染色法亦可應(yīng)用于診斷泌尿系結(jié)核患者，該檢驗(yàn)方法有可能在泌尿系結(jié)核的早期診斷中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討建立泌尿系結(jié)核的尿沉渣改良抗酸染色法，并進(jìn)一步明確其臨床應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)將傳統(tǒng)的抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)及改良抗酸染色法三種檢測(cè)方法本別應(yīng)用到泌尿系結(jié)核病例的診斷中，分析比較診斷結(jié)果，以評(píng)估各種方法對(duì)診斷泌尿系結(jié)核病的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

以2014年5月至2017年11月期間，在武漢市金銀潭醫(yī)院診斷泌尿系結(jié)核病的病人為研究對(duì)象，84例入組病例均符合全國(guó)結(jié)核病分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，且抗結(jié)核治療有效，并經(jīng)隨訪確診［1］。全部患者24小時(shí)尿沉渣均為首次采集，其中一側(cè)腎結(jié)核、輸尿管結(jié)核病變58例，男性52例，女性6例，患者年齡19-85歲，平均年齡48.15±22.73歲；雙側(cè)病變26例，男性10例，女性16例，患者年齡18-80歲，平均年齡47.11±18.59歲。合并其他系統(tǒng)結(jié)核?。ㄈ缂怪Y(jié)核、髖關(guān)節(jié)結(jié)核、腸結(jié)核、陰囊結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腹膜炎、頸淋巴結(jié)結(jié)核、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核、肺結(jié)核等)50例，約占59.5%.采集時(shí)未經(jīng)抗結(jié)核治療患者48例，已進(jìn)行抗結(jié)核治療患者36例：其中治療1-30天者20例，治療＞30天者16例（其中2例耐藥、4例因過(guò)敏等嚴(yán)重藥物不良副反應(yīng)未能完成抗結(jié)核療程）。

1.2 方法

每例尿沉渣標(biāo)本同時(shí)送檢傳統(tǒng)的抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)及改良抗酸染色法。

傳統(tǒng)抗酸菌涂片染色法：留取24小時(shí)尿液，靜置，傾去上清液，留取沉淀，通過(guò)離心、涂片、固定、石碳酸復(fù)紅染液染色、沖洗、美藍(lán)染色、沖洗、瀝干、干燥等程序，再使用10×100倍鏡檢。

改良羅氏培養(yǎng)法：指導(dǎo)患者連續(xù)留取三天尿液標(biāo)本，每天取24小時(shí)尿液。靜置，傾去上清液，留存沉淀部分20-30毫升，均保存在2-8攝氏度的冰箱中?；旌先斓哪蛞哼M(jìn)行培養(yǎng)檢測(cè)。通過(guò)離心、在培養(yǎng)基上接種、在培養(yǎng)箱中孵育的流程進(jìn)行培養(yǎng)操作［16］。定時(shí)判讀有無(wú)菌落生長(zhǎng)。若培養(yǎng)基的斜面上發(fā)現(xiàn)菌落出現(xiàn)，則選取菌落做涂片完成抗酸染色的檢查。

改良抗酸染色法：前期用3-氨丙基-3-乙氣基甲硅烷工作溶液處理載玻片，晾干備用。囑患者留取全天24小時(shí)的尿液，靜置，丟棄上清液，只留下尿液沉淀部分。用粟氏FMU細(xì)胞涂片沉淀器裝盛0.5毫升尿液沉渣，以500-700轉(zhuǎn)/分鐘的速度將標(biāo)本離心3-5分鐘后尿液的有形成分沉積在玻片上，再以4%多聚甲醛溶液將玻片固定15分鐘，通過(guò)水洗并晾干。接下來(lái)使用0.3%Trition-100溶液將玻片浸泡15分鐘，再使用0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖液將玻片沖洗3次并晾干［2］。使用0.3%TritonX-100石碳酸復(fù)紅溶液染色玻片5分鐘，再水洗。使用3%鹽酸乙醇脫色1分鐘，水洗、晾干。最后使用堿性亞甲藍(lán)復(fù)染5分鐘后再水洗。自然干燥后，使用10×100倍鏡檢［5］。

1.3 結(jié)果

以國(guó)際公認(rèn)的國(guó)家結(jié)核病公職規(guī)劃(RN-TCP)指南為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果，改良抗酸染色法和傳統(tǒng)的Ziehl-Neelsen染色法所檢測(cè)到的抗酸桿菌均呈現(xiàn)為紅色［8］。在100個(gè)顯微鏡視野內(nèi)可見(jiàn)10-100條抗酸桿菌即為抗酸染色（+），若檢測(cè)值低于以上標(biāo)準(zhǔn)即為抗酸染色陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用通用的SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件作數(shù)據(jù)歸納。使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（)來(lái)表示計(jì)量資料。通過(guò)McNemar x2檢驗(yàn)，分別比較Ziehl-Neelsen染色法、培養(yǎng)法和改良染色法各自對(duì)抗酸桿菌的檢出率；通過(guò)x2檢驗(yàn)法，比較改良法在已治療者和未治療患者中的抗酸桿菌陽(yáng)性的檢出率。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

表1 84例患者尿液檢查改良法與傳統(tǒng)法抗酸桿菌檢測(cè)結(jié)果（n）

表2 84例患者尿液檢查改良法與培養(yǎng)法抗酸桿菌檢測(cè)結(jié)果（n）

2 結(jié)果

84例泌尿系結(jié)核病患者尿液改良法和傳統(tǒng)法、培養(yǎng)法抗酸桿菌檢出率分別為57.14%（48/84）和4.76%（4/84）和26.19%（22/84），三者比較之差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，表2）。

48例未治療患者尿液檢查改良法和傳統(tǒng)法、培養(yǎng)法的抗酸桿菌檢出率分別為62.5%（30/48）和4.16%（2/48）和37.5%（18/48），三者比較之差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表 3、表4）。

表3 48例未治療患者的尿液Ziehl-Neelsen染色法與改良法抗酸桿菌檢測(cè)結(jié)果（n）

表4 48例未治療患者尿液改良法和培養(yǎng)法抗酸桿菌檢測(cè)結(jié)果（n）

隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，尿沉渣內(nèi)分支桿菌數(shù)量不斷減少，各種方法對(duì)抗酸桿菌的檢出數(shù)量均顯著降低。但在對(duì)治療時(shí)間大于一個(gè)月的16例病案的檢測(cè)中，改良法仍然檢測(cè)出6例（+），其中一位患者在藥物治療4個(gè)半月后尿沉渣中仍能通過(guò)改良法檢測(cè)出抗酸桿菌。

未治療和已治療的患者尿液改良法的抗酸桿菌檢出率分別為62.5%（30/48）和50%（18/36），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表5）。

表5 未治療患者與已治療患者尿沉渣改良法的抗酸桿菌檢測(cè)結(jié)果（p＜0.05）

3 討論

目前在泌尿結(jié)核（腎結(jié)核、輸尿管結(jié)核、膀胱結(jié)核等）的診斷過(guò)程當(dāng)中，醫(yī)學(xué)影像學(xué)和病原微生物學(xué)檢查被最廣泛的接受和使用。在泌尿系結(jié)核疾病的早期，超聲多普勒的診斷意義極其有限，往往多普勒檢查只用于疾病的初篩和復(fù)查［4］。雖然CT或IVU的典型征象對(duì)中晚期泌尿系結(jié)核具有確診的價(jià)值［5］，但此時(shí)疾病的治療難度大、治療費(fèi)用昂貴、患者預(yù)后也差。由此可見(jiàn)，對(duì)泌尿系結(jié)核病的早期臨床診斷而言，微生物病原學(xué)檢查價(jià)值更大。

傳統(tǒng)Ziehl-Neelsen染色法，其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備的要求很低，檢測(cè)時(shí)間短，僅需1-2個(gè)小時(shí)就可以出報(bào)告，而且病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)輕，可廣泛用于結(jié)核病的篩查；短板在于其準(zhǔn)確率跟檢驗(yàn)操作者的熟練程度相關(guān)，而且檢驗(yàn)靈敏度相對(duì)低，陽(yáng)性率通常在25%-28%［1］.而且必須在每毫升標(biāo)本內(nèi)存在 5000-10000條菌的前提下才可檢測(cè)出陽(yáng)性報(bào)告。

由于有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，相對(duì)被污染的幾率小、實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)便，對(duì)儀器設(shè)備水平要求低等優(yōu)點(diǎn)，而且還可以進(jìn)一步進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)和菌型鑒定來(lái)指導(dǎo)臨床治療，改良羅氏培養(yǎng)法一直被看做臨床上結(jié)核病診斷的"黃金標(biāo)準(zhǔn)”［6］。但此法的缺點(diǎn)也顯而易見(jiàn)：實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，可能延誤診斷和治療，而且于前期的經(jīng)驗(yàn)性抗結(jié)核治療可能引起繼發(fā)性耐藥導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果不能精準(zhǔn)、適時(shí)的運(yùn)用于臨床。

近年來(lái)新興的熒光定量PCR、結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT)和GeneExpert等檢測(cè)技術(shù)，雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短［15］，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求極高［19］、診斷成本較高，病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重，故目前尚未能在臨床廣泛開(kāi)展。

綜上所述，抗酸染色法雖然存在著陽(yáng)性率低和其他一些劣勢(shì)，但目前仍是腎結(jié)核、輸尿管結(jié)核、膀胱結(jié)核等疾病確診的主要方法［2］。

離心對(duì)傳統(tǒng)的染色和培養(yǎng)法都是必不可少的重要步驟，離心的主要作用是濃集抗酸桿菌，但離心的過(guò)程可能進(jìn)一步丟失掉本身數(shù)量就有限的分枝桿菌。針對(duì)傳統(tǒng)方法離心過(guò)程中可能丟失上浮的抗酸桿菌、分枝桿菌在離心過(guò)程中由于緊貼在管壁而沒(méi)能集中到底部導(dǎo)致進(jìn)一步丟失、在染色水洗的過(guò)程導(dǎo)致分支桿菌丟失等問(wèn)題［7］，改良法使用了Cytospin玻片離心沉淀儀，通過(guò)合理使用濾紙等方式，有效地克服了以上弊端，最終使尿液有形成分的沉淀面積（直徑6毫米）遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)方法，達(dá)到了濃縮集菌的目的［11］。

針對(duì)結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁富含脂質(zhì)，改良法所使用的TritonX-100是一種非離子型表面活性劑［14］，它可以溶解分枝桿菌菌細(xì)胞壁所富含的脂質(zhì)，以此增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)染色劑的通透程度［9］，從而增加胞內(nèi)抗酸桿菌的檢出率，提高染色的陽(yáng)性率。

本研究顯示，對(duì)于腎結(jié)核、輸尿管結(jié)核、膀胱結(jié)核等患者，改良法對(duì)尿液的抗酸桿菌檢出率顯著顯高于Ziehl-Neelsen染色法（P均=0.000），這與在結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中所作出的研究結(jié)論相符［7］。特別對(duì)于尚未開(kāi)始抗結(jié)核治療的病例，改良法針對(duì)尿液中抗酸桿菌檢出率達(dá)到62.5%，而Ziehl-Neelsen染色法僅為4.16%，其陽(yáng)性檢出率有質(zhì)的提升［10］。這對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療病人意義重大。

經(jīng)過(guò)有效抗結(jié)核治療的患者，其抗酸桿菌的檢出率呈不斷下降趨勢(shì)。本研究中，對(duì)于2例耐藥和4例因嚴(yán)重藥物副反應(yīng)未能完成抗結(jié)核治療的病例，改良法亦從患者后期的尿液中檢出了抗酸桿菌。提示改良抗酸染色法不僅可用于早期診斷，而且在及時(shí)反映患者病情演變、監(jiān)測(cè)療效等方面，也具有傳統(tǒng)檢測(cè)方法所不具備的治療指導(dǎo)意義。

傳統(tǒng)的Ziehl-Neelsen染色法在操作過(guò)程中將細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全破壞，故無(wú)法檢測(cè)出細(xì)胞內(nèi)的分枝桿菌［12］。但在本研究中，通過(guò)改良法有30例患者檢出了胞內(nèi)的抗酸桿菌。改良法使用特殊處理的載玻片以及粟氏FMU細(xì)胞涂片沉淀器，能夠最大程度的保留尿沉渣標(biāo)本中細(xì)胞的原始結(jié)構(gòu)，再通過(guò)TritonX-100使胞內(nèi)菌體更充分的著色來(lái)檢出胞內(nèi)分支桿菌［21］。往往因?yàn)榫w形態(tài)的不典型，細(xì)胞外的抗酸桿菌很容易與一般雜質(zhì)相混淆，改良法對(duì)胞內(nèi)菌的檢出可以成功避開(kāi)這個(gè)矛盾，檢測(cè)特異性更高。

綜上所述，改良法能提升抗酸桿菌檢出率，可以同時(shí)檢測(cè)出細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的抗酸桿菌，而且對(duì)抗結(jié)核治療過(guò)程中患者標(biāo)本的檢出陽(yáng)性率也高于傳統(tǒng)Ziehl-Neelsen染色法。因此，通過(guò)改良法檢測(cè)尿沉渣中的抗酸桿菌，對(duì)于泌尿系結(jié)核患者的早期診斷和治療，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值，且該方法操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，檢驗(yàn)成本低，尿液標(biāo)本容易獲取，患者沒(méi)有二次感染的風(fēng)險(xiǎn)，適合在廣大的基層醫(yī)院廣泛開(kāi)展。

雖然改良法在泌尿結(jié)核病的診斷上較傳統(tǒng)方法有很大改進(jìn)，但由于仍可能存在假陰性或假陽(yáng)性報(bào)告［20］，其檢測(cè)的特異性和靈敏度需要在臨床中進(jìn)一步驗(yàn)證并指導(dǎo)方法改進(jìn)。由于改良抗酸染色法只能檢出抗酸桿菌，不能分辨是否為結(jié)核分枝桿菌，也不能提供檢出菌是否致病狀態(tài)或潛伏感染狀態(tài)的依據(jù)［17］，故臨床上還需要進(jìn)一步分析判斷以決定最終治療。因此，完整的泌尿系結(jié)核診斷仍然需要將病史特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、影像學(xué)資料、病理學(xué)診斷、診斷性治療的療效等多方面因素相結(jié)合進(jìn)行綜合分析研判，才能精準(zhǔn)提升泌尿系結(jié)核病的及時(shí)診斷率，為早期、規(guī)則的抗結(jié)核治療贏得寶貴時(shí)機(jī)。