張 健， 姜素平， 蔣繼宏， 鞠秀云

(江蘇師范大學 生命科學學院 江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 徐州 221116)

自1928年青霉素被發(fā)現(xiàn)以來，抗生素藥物得到了迅速、全面的發(fā)展，已成為現(xiàn)代醫(yī)學的一個支柱[1]。但隨著抗生素的長期大量使用，越來越多的細菌產(chǎn)生了耐藥性，因此研發(fā)新的抗生素迫在眉睫[2]。內(nèi)生真菌是指在其生活史的一定階段或全部階段，生活于健康植物各種組織和器官細胞間隙或細胞內(nèi)的真菌，在與宿主植物協(xié)同進化過程中能產(chǎn)生多種獨特的次生代謝產(chǎn)物[3]。自1993年Stiere等[4]報道從短葉紅豆杉中分離到能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌以來，人們已從藥用植物中分離獲得一些能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌。如：姚裕群等[5]從越南槐中分離到1株疣孢漆斑菌，其代謝產(chǎn)物具有強的抗白念珠菌活性； Pinheiro等[6]從紫荊花中分離到1株內(nèi)生真菌嘴突臍孢(Exserohilumrostratum)，其甲醇提取物對所測試的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等表現(xiàn)出較好的活性，顯示出廣泛的抗菌譜。毛泡桐是玄參科泡桐屬植物，泡桐屬共有7個種，分別是白花泡桐(Paulowniafortunei(Seem.) Hemsl.)、毛泡桐(Paulowniatomentosa(Thunb.)Steud.)、蘭考泡桐(PaulowniaelongataS.Y.Hu)、椒葉泡桐(PaulowniacatalpifoliaGong Tong)、臺灣泡桐(PaulowniakawakamiiIto)、川泡桐(PaulowniafargesiiFranch.)和南方泡桐(PaulowniaaustralisGong Tong)[7]。泡桐屬植物不僅是一種優(yōu)質(zhì)木材，在工農(nóng)業(yè)方面有著廣泛用途，同時還是一種常用的中草藥，其花、葉、皮、根、果古時就有藥用記載，如《本草綱目》記述:“桐葉主惡蝕瘡著陰，皮主五痔，殺三蟲?；ㄖ鞲地i瘡，消腫生發(fā)”[8]。對泡桐屬植物的化學成分研究始于20世紀30年代，人們先后分離得到糖苷類化合物[9]、木脂素類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、倍半萜類、三萜類等，其中許多化合物被證明具有一定的抑菌[10]、消炎[11]、抗衰老[12-13]和抗腫瘤[14]等生物活性。但有關(guān)泡桐屬植物內(nèi)生真菌的研究鮮有報道，羅江華等[15]對白花泡桐的內(nèi)生真菌進行分離，僅得到19株內(nèi)生真菌；而有關(guān)毛泡桐內(nèi)生真菌的研究未見報道。本研究對河南毛泡桐進行內(nèi)生真菌的分離、鑒定及其抑制細菌活性的篩選，為尋找新型藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物樣本 毛泡桐根、莖和葉于2016年7月采自河南鄭州和新鄉(xiāng)兩個地區(qū)。

1.1.2 指示菌 大腸埃希菌(Escherichiacoli)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)均由江蘇省藥食植物生物技術(shù)重點實驗室提供及保存。

1.1.3 培養(yǎng)基[16]分離培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基；純化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄固體培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)；發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基；細菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

1.1.4 主要試劑 ITS4和ITS5由上?？〗萆锕こ逃邢薰竞铣?，rDNA-ITS的擴增試劑由上海生工生物股份有限公司生產(chǎn)，青霉素鉀(400萬單位)由合肥中龍神力動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，乙酸乙酯、丙酮等有機試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.5 儀器及設(shè)備 熒光細胞成像顯微鏡(742BR1815型)、電泳儀(041BR型)、凝膠成像儀(Universal HoodⅡ型)，均為美國BIO-RAD公司；PCR儀(Varies，美國Applied Biosystems公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100D-W，上海申生科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 毛泡桐內(nèi)生真菌的分離和純化 用自來水將采集的新鮮無病癥的毛泡桐根、莖和葉表面污垢沖洗干凈，自然風干，分別切成約1.5 cm的小段，無菌條件下進行表面消毒：無菌水沖洗3次、5%次氯酸鈉溶液消毒(葉3 min，莖4 min，根5 min)、2.5%硫代硫酸鈉蕩洗1 min、無菌水沖洗3次、75%酒精浸泡2 min、無菌水洗滌3次。將表面消毒后的樣本切成0.3 cm×0.3 cm大小的塊狀，接種于3種分離培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；同時將上述表面滅菌時最后一次沖洗的無菌水取200 μL涂布于分離培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)，檢查表面滅菌是否干凈。3～10 d后，挑取形態(tài)不同的菌絲或菌落移接到PDA培養(yǎng)基上進行純化，保存純化后的菌株，備用。

1.2.2 抗細菌活性菌株初篩 采用瓊脂塊法對分得的內(nèi)生真菌進行抑菌活性的初選。具體步驟：用打孔器從PDA平板生長的菌落上截取直徑為6.0 mm的瓊脂塊，用無菌鑷子將瓊脂塊放置于涂有指示菌(約1×108cfu/mL)的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d，觀察及測量抑菌圈直徑。

1.2.3 抗細菌活性菌株復篩 采用濾紙片擴散法對活性菌株進行復篩。將初篩得到的活性菌株接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min培養(yǎng)7 d。所得發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過濾分為發(fā)酵液和菌絲體兩部分，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮得浸膏E(乙酸乙酯相)；菌絲體用丙酮浸泡提取，減壓濃縮得浸膏A(丙酮相)。吸取細菌菌液(約1×108cfu/mL)100 μL涂布于LB平板上，在適當位置貼上己滅菌的濾紙片(Φ=6 mm)。以50%丙酮為溶劑，將浸膏E和浸膏A分別配成10 mg/mL溶液，用500 μg/mL的青霉素鉀溶液做陽性對照，50%丙酮作陰性對照。分別吸取20 μL上述溶液滴于濾紙片上，每個樣品重復3次。37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察，測抑菌圈大小。

1.2.4 抗細菌活性真菌的鑒定 形態(tài)特征：采用插片法對復篩得到的活性菌株進行培養(yǎng)，觀察其菌落、菌絲和孢子特征，參照《真菌鑒定手冊》進行形態(tài)描述[17]?；钚跃闕TS序列測定及系統(tǒng)發(fā)育學分析：真菌DNA的提取采用微波法[18]，利用真菌通用引物ITS4(5′-TCCGCTTATTGATATG C-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-G-3′)經(jīng)PCR從真菌基因組DNA中擴增出rRNA基因的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITSs)。程序反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃、0.5 min，58 ℃ 1 min，72 ℃1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進行純化和測序。將測得的ITS序列在NCBI上進行序列比對，根據(jù)比對結(jié)果選擇相似性較高的菌株序列，利用MEGA5.01軟件以Neighbor-Joining計算方式生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制細菌活性初篩

從毛泡桐的根、莖、葉中共分得46株菌落特征有差異的內(nèi)生真菌，其中從根中分得3株，莖中分得18株，葉中分得25株。利用瓊脂塊法對46株內(nèi)生真菌進行抑制細菌活性的篩選，結(jié)果表明共有9株內(nèi)生真菌對至少1株指示菌具有抑制活性，其中KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686對3株及以上指示菌具有很好地抑制作用(表1)。

表1 抑制細菌的內(nèi)生真菌統(tǒng)計Table 1 Statistics of endophytic fungi with antibacterial capabilities

2.2 抑制細菌活性復篩

選取抗細菌活性較好的菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686，利用濾紙片擴散法測定其發(fā)酵液乙酸乙酯相和菌絲體丙酮相對4種指示菌的抑制作用。結(jié)果顯示：菌株KLBMP-Pt630發(fā)酵液乙酸乙酯相對枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和青枯假單胞菌的抑菌圈平均直徑分別為13、12和11 mm，菌株KLBMP-Pt675發(fā)酵液乙酸乙酯相對枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和青枯假單胞菌的抑菌圈平均直徑分別為11、15、14和11 mm，菌株KLBMP-Pt686發(fā)酵液乙酸乙酯相對枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和青枯假單胞菌的抑菌圈直徑分別為21、11和23和20 mm。同等濃度下3株菌的菌絲體丙酮提取物對4種指示菌無明顯抑制作用。陽性對照在此濃度下對大腸埃希菌沒有顯示出抑制作用，對枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和青枯假單胞菌抑菌圈平均直徑為39、12和24 mm。陰性對照對4株菌均無抑制作用，如圖1所示。

菌株KLBMP-Pt630的發(fā)酵液乙酸乙酯相對金黃色葡萄球菌的活性與陽性對照相同，對枯草芽胞桿菌和青枯假單胞菌活性要弱于陽性對照，對大腸埃希菌沒有作用；菌株KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686的發(fā)酵液乙酸乙酯相對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的活性大于陽性對照，對枯草芽胞桿菌和青枯假單胞菌的活性弱于陽性對照。內(nèi)生真菌KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686對4株細菌均具有活性。

圖1 3株高活性內(nèi)生真菌的發(fā)酵液乙酸乙酯相對4種指示菌的抑制作用Fig.1 Antibacterial capabilities of metabolites from three strains endophytic fungi

2.3 菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675、KLBMP-Pt686的形態(tài)特征

菌株KLBMP-Pt630菌落特征為菌絲繁密呈絨狀，顏色幼時為白色后逐漸變?yōu)榧t褐色，在PDA上產(chǎn)玫瑰紅色素；菌絲具有明顯的分隔，分生孢子座中的大型分生孢子呈鐮刀狀，腹部彎曲，頂細胞漸尖，具有2～5個隔膜(圖2中A1和A2)。菌株KLBMP-Pt675菌落質(zhì)地絲絨狀，菌絲體白色，分生孢子結(jié)構(gòu)呈暗藍綠色；顯微觀察其分生孢子頭為棒形，壁較薄，光滑無色，頂囊由孢梗莖頂端逐漸膨大成為棍棒形，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，瓶梗密集著生于頂囊的全部表面(圖2中B1和B2)。菌株KLBMP-Pt686菌落顏色為淡黃色，菌落稠密，呈肉質(zhì)狀，色澤鮮艷；菌絲呈絲狀，分生孢子梗輪生，頂端著分生孢子，分生孢子呈梭型(圖2中C1和C2)?；谛螒B(tài)學特征比較，菌株KLBMP-Pt630初步鑒定為鐮刀菌屬、菌株KLBMP-Pt675初步鑒定為曲霉屬、菌株KLBMP-Pt686初步鑒定為肉座菌。

圖2 菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strains KLBMP-Pt630, KLBMP-Pt675 and KLBMP-Pt686

2.4 菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675、KLBMP-Pt686的ITS序列分析

利用引物ITS4和ITS5經(jīng)PCR分別擴增出菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686的ITS序列進行測序分析，長度分別為568、597和623 bp，參考GenBank比對結(jié)果，利用MEGA 5.01軟件以Neighbor-Joining計算方式生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖3所示。KLBMP-Pt630 與Fusariumtricinctum在同一個分支內(nèi)，序列相似性為99%；KLBMP-Pt675被聚類在Aspergillus組中，與Aspergillusclavatus相似性為99%；KLBMP-Pt686與Hypocrealessp. E14023c相似性為99%。結(jié)合3株菌的形態(tài)學觀察結(jié)果，菌株KLBMP-Pt630初步鑒定為三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)，菌株KLBMP-Pt675鑒定為棒曲霉(Aspergillusclavatus)，菌株KLBMP-Pt686鑒定為肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)。

圖3 菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenic tree of ITS sequences of strains KLBMP-Pt630, KLBMP-Pt675 and KLBMP-Pt686

3 討 論

植物內(nèi)生菌作為一種新型微生物資源，具有種類繁多、蘊藏量大的特點。研究表明，從植物內(nèi)生真菌中可發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎且具有較高活性的次生代謝產(chǎn)物，其中的一些化合物具有很強的抗菌能力，具有開發(fā)成新的抗菌藥物的潛力[19]。目前為止，許多研究者已從不同的植物內(nèi)生真菌中分離得到大量具有抗菌活性的新化合物。Zhou等[20]從紅樹林植物木欖Bruguieragymnorrhiza中分到1株青霉菌Penicilliumsp. GD6，從其代謝產(chǎn)物中分離得到1個新雙吡咯烷類生物堿，對金黃色葡萄球菌具有極強的抑菌活性。Tejesvi等[21]從杜鵑類灌木中分離出1株三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)，能夠產(chǎn)生1種抗菌肽，對白色念珠菌和葡萄球菌具有很好地抑制作用。本研究選取2株典型的人類病原細菌、1株植物病原細菌和1株枯草芽胞桿菌作為指示菌，對分離自毛泡桐葉、莖、根中的46株內(nèi)生真菌進行抑制細菌活性篩選，得到3株具有廣譜抑菌的內(nèi)生真菌，分別記為KLBMP-Pt630、 KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686。其中菌株KLBMP-Pt686的乙酸乙酯提取物活性極強，尤其是對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌活性，比檢測時用的500 μg/mL青霉素鉀活性要高。菌種鑒定未能鑒定到種，序列比對時對比的菌株Hypocrealessp. E14023c(KF466233)也沒有進行過相關(guān)研究。因此，對菌株KLBMP-Pt686的進一步研究，可能得到一些新的抗菌物質(zhì)。