馮 敏， 吳紅艷， 王志學(xué)， 郭玲玲， 李 贊

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽 122000)

土壤是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，是作物生長的重要營養(yǎng)源泉，土壤微生物是土壤的重要組成部分，其在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)、系統(tǒng)穩(wěn)定性和抗干擾以及土壤可持續(xù)發(fā)展中占據(jù)主導(dǎo)地位。秸稈還田不僅可以改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力，而且對土壤的生物學(xué)特性也具有很重要的影響[1]。微生物群落結(jié)構(gòu)不僅決定了生態(tài)功能的特性和強(qiáng)弱，而且群落結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性是實現(xiàn)生態(tài)功能的重要因素，群落結(jié)構(gòu)變化是標(biāo)記環(huán)境變化的重要方面[2]。因此，通過對秸稈生物降解專用菌種施用后土壤菌群進(jìn)行研究并分析其動態(tài)變化，可以為優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)群落功能和發(fā)現(xiàn)新的重要微生物功能類群提供依據(jù)。目前，微生物群落的分析方法很多，包括傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法、CLPP、生物標(biāo)記物方法、現(xiàn)代分子生物學(xué)方法等。研究表明，土壤中只有不到1%的微生物是可培養(yǎng)的，因此采用傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)方法很難真實反映秸稈還田后土壤微生物結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，而且繁瑣耗時[3]，不能用于監(jiān)測種群結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。而現(xiàn)代分子生物學(xué)方法以微生物基因組DNA的標(biāo)記序列為分類依據(jù)，通過分析不同DNA分子的種類及其數(shù)量來反映微生物的種群結(jié)構(gòu)。方法包括群落水平總DNA分析、核酸雜交技術(shù)、克隆文庫、基因指紋圖譜技術(shù)等。目前每一類方法都有自身的優(yōu)點和局限性，都處于發(fā)展和完善中，并相互補(bǔ)充相互推動。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法積累了種群分類的大量數(shù)據(jù)，為生物標(biāo)記物方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)提供了良好的背景材料(例如用作標(biāo)準(zhǔn)品或分子工具)，在功能特性的認(rèn)識上有獨特的優(yōu)勢?，F(xiàn)代分子生物學(xué)提高了解析的靈敏度，在基因水平上擴(kuò)大了物種多樣性的視野，其中基因指紋技術(shù)(包括DGGE電泳系統(tǒng)化)可同時分析多個樣品，通過電泳后條帶的直觀顯示可分析種群結(jié)構(gòu)的變化情況，從而分析秸稈生物降解專用菌種施用后對土壤群落動態(tài)變化的影響[4]。而這一方法是通過提取土壤中徽生物總DNA，經(jīng)純化處理后，利用合適的引物擴(kuò)增，通過DGGE電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物推斷秸稈生物降解專用菌種施用后土壤中細(xì)菌數(shù)量變化規(guī)律。本研究通過對土壤微生物基因組DNA提取方法、PCR擴(kuò)增條件、DGGE電泳條件的研究，并對結(jié)果進(jìn)行比較，得出合適條件，對土壤中微生物數(shù)量變化規(guī)律進(jìn)行分析，為后續(xù)的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 取樣地點在遼寧省朝陽市北票市馬友營鄉(xiāng)農(nóng)戶蔬菜大棚內(nèi)，實驗樣品為秸稈生物降解專用菌種施用后定期取得(施用后每15 d取樣1次)。用無菌小鋼鏟取秸稈上0～10 cm土壤作為樣品，過20目篩后備用。

1.1.2 試劑 溶菌酶、Hind Ⅲ、DL2000 maker及BamH I酶、DV805A膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶、聚丙烯酰胺、尿素、甲酰胺等均購自Takara公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(UPH-120-1020L)，高速冷凍離心機(jī)(SiGMA 3K15)，恒溫水浴鍋，恒溫培養(yǎng)箱(SPH-2102)，脫色搖床(TS-1，江蘇自動化儀器廠)，恒壓恒流電泳儀(DF-C，北京東方儀器廠)，紫外透射反射分析儀(ZF1-Ⅱ，上海嘉鵬有限公司)，PCR儀(Appolied Biosystems)，變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)(TV400-DGGE)。

1.2 方法

1.2.1 土壤微生物基因組DNA提取的研究 具體方法參照文獻(xiàn)[5-6]。①直接提取法樣品處理：稱取5 g土壤樣品，與10.0 mL TE(pH 8.0)緩沖液(含玻璃珠)混合均勻，30 ℃搖床180 r/min震蕩提取30 min,10 000 r/min離心15 min,洗滌1次，10 000 r/min離心15 min，收集沉淀即為沉淀1。②間接提取法樣品處理：稱取土壤樣品5 g，與10.0 mL TE(pH 8.0)緩沖液(含玻璃珠)混合均勻，30 ℃搖床180 r/min震蕩提取30 min,1 500 r/min離心20 min,收集上層濁液，洗滌沉淀1次，1 500 r/min離心15 min，合并上層濁液，10 000 r/min離心15 min，收集沉淀即為沉淀2。 ③直接提取法和間接提取法均按下述提取方法提?。悍謩e將沉淀1、2置-20 ℃冰箱中冷凍過夜，次日融化后加入5 mL TE緩沖液(pH 8.0)混合均勻，加入200 μL(50 mg/mL)溶菌酶使用液(終濃度為1 mg/mL)，37 ℃水浴搖床120 r/min 2～3 h，加入10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS 1 mL(終濃度2%)，60 ℃水浴30 min，加入5 moL/L NaClO 42 mL(終濃度1 mol/L),混合均勻，加入等體積的氯仿∶ 異戊醇混合液，振蕩10 min，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，無水乙醇低溫沉淀過夜，12 000 r/min離心20 min，收集沉淀，70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心15 min，收集沉淀DNA，TE緩沖液(pH 8.0)溶解，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 土壤中粗基因組DNA的純化 DV805A膠回收試劑盒按說明書進(jìn)行純化回收。

1.2.3 土壤細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增 具體方法參照文獻(xiàn)[7]。引物為16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增的通用引物并在序列中加入GC夾子，由賽百盛生物有限公司合成。擴(kuò)增條件：采用降落式PCR,每個循環(huán)溫度降低0.5 ℃。擴(kuò)增體系見表1。

表1 土壤細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增體系Table 1 V3 domain PCR amplification amplification system of soil bacteria 16S rDNA

1.2.4 DGGE電泳分離土壤細(xì)菌16S rDNA V3 PCR擴(kuò)增片段 具體方法參照文獻(xiàn)[8-9]。聚丙烯酰胺凝膠凝膠組成見表2，其中各組成中均加入APS 50 μL、TEMED 15 μL。

表2 聚丙烯酰胺凝膠凝膠組成Table 2 Gel Components of polyacrylamide gel

DGGE電泳條件及凝膠染色、顯色：變性劑濃度分別為25%～35%、35%～55% 和35%～65%，電壓為200 V，溫度60 ℃，蠕動泵流速為5 mL/min，電泳時間為4～5 h，取下膠片后用銀染方法進(jìn)行染色，洗滌、顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤粗基因組DNA的提取及純化

土壤粗基因組DNA的提取物凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，兩種方法均從土樣中提取到微生物基因組DNA，片段長度約為23 kb(如圖A、B)，直接法得到小分子多，DNA碎片多，電泳時形成拖尾，但濃度較高；而間接法得到的DNA片段集中，小分子物質(zhì)少，電泳拖尾情況相對較輕，但濃度較低。經(jīng)過DV805A膠回收試劑盒純化后得到足夠純度的土壤基因組DNA。

圖1 土壤粗基因組DNA的提取物凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.1 Gel electrophoresis determination results of soil crude genotypic DNA extract

2.2 土壤細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增

土壤細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增后凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，所有擴(kuò)增產(chǎn)物均在250 bp附近有一條明亮的DNA帶，但是在100 bp附近也均有明亮程度不同的條帶，即小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)條帶1號和3號最為明亮，2號次之，最淡的為4號，說明4號擴(kuò)增體系所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物比其他3個擴(kuò)增體系得到的擴(kuò)增產(chǎn)物較為純凈。

2.3 DGGE電泳分離

DGGE電泳分離土壤細(xì)菌16S rDNA V3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，變性劑濃度范圍較大的35%～65%，電泳分離效果較差，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，條帶不清晰；而變性劑濃度較小且范圍較小的25%～35%，樣品在大分子處集中，DGGE電泳分離效果差，而變性劑濃度適中，范圍在35%～55%時分離效果較好，條帶清楚，因而可用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE分離。

圖2 土壤細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增后凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.2 Determination results by gel electrophoresis of soil bacteria 16S rDNA after V3 domain PCR amplification1：不含Mg2+和BSA；2：含Mg2+和BSA；3：含Mg2+但不含BSA；4：不含Mg2+含有BSA1: Not contained Mg2+and BSA; 2: Contained Mg2+ and BSA; 3: Contained Mg2+ but not contained BSA; 4: Not contained Mg2+ but contained BSA

圖3 DGGE電泳分離土壤細(xì)菌16S rDNA V3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果Fig.3 Results of V3 PCR amplified products of soil bacteria 16S rDNA isolated with DGGE

3 討 論

在研究土壤中粗基因組DNA提取過程中，直接法和間接法提取所得DNA片段長度均在23 kb左右，與文獻(xiàn)報道一致。另外，提取后除了進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測外，還進(jìn)行了BamH I酶切反應(yīng)及PCR擴(kuò)增試驗，結(jié)果表明，未經(jīng)純化的直接法提取得到的基因組DNA酶切反應(yīng)不能進(jìn)行，PCR擴(kuò)增無法擴(kuò)增出條帶，這說明直接法提取的DNA中含有大量雜質(zhì)，能強(qiáng)烈抑制PCR擴(kuò)增和BamH I酶切反應(yīng)，而純化后可有效消除抑制因子的作用。由于直接法得到的基因組DNA中細(xì)菌種群更加豐富，所以對直接法得到的DNA純化后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增效果更好。

在進(jìn)行PCR擴(kuò)增體系和條件研究時，常規(guī)的體系中加入了BSA，以增強(qiáng)保護(hù)DNA聚合酶的活性，增強(qiáng)PCR反應(yīng)過程中的特異性[10]；另外，在體系中試圖加入Mg2+使其與DNTP相互作用，增加擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量，結(jié)果作用不明顯，未使用[11]；由于DNA分子中的G、C堿基對要比A、T堿基對結(jié)合得牢固，因此G、C含量高的區(qū)域具有較高的解鏈溫度，使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在DGGE電泳過程中不至于雙鏈被完全打開，形成單鏈[12]?；谶@一原理，在設(shè)計引物時加入了GC夾子，即將一段長度為30～50 bp富含G、C的DNA堿基片段附加到雙鏈的一端以形成一個人工高溫解鏈區(qū)，使DNA片段的原有部分處于低溫解鏈區(qū)，從而實現(xiàn)更好地分離[13]。

DGGE電泳的聚丙烯酰胺凝膠組成和電泳條件決定電泳結(jié)果成功與否，其中變性劑濃度尤為重要，其次APS 和TEMED的加入量以及膠片取下后銀染的時間等因素對于電泳結(jié)果也起到至關(guān)重要的作用[14-15]。

總之，通過對DGGE電泳相關(guān)條件的研究，明確了土壤中粗基因組DNA提取方法，確定了PCR擴(kuò)增條件和DGGE電泳系統(tǒng)組成中變性劑濃度，為后續(xù)的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。