參芪苡術(shù)湯通過Wnt/β-catenin通路調(diào)控胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究

徐建林，陸為民

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院，江蘇 鹽城 224000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210029）

胃癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，目前主要認(rèn)為與遺傳因素、環(huán)境因素、飲食因素、胃部微生態(tài)等因素有關(guān)。近年來利用分子生物學(xué)手段研究胃癌的發(fā)病機(jī)制和有效藥物對(duì)胃癌的作用機(jī)制，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。有研究[1]認(rèn)為中醫(yī)學(xué)可以通過健脾化痰散結(jié)法來逆轉(zhuǎn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化達(dá)到治療胃癌的目的。參芪苡術(shù)湯是國醫(yī)大師徐景藩教授治療胃癌的基本方，臨床療效明顯。本實(shí)驗(yàn)研究圍繞Wnt/β-catenin信號(hào)通路，探討參芪苡術(shù)湯對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）以及Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Vimentin、p-Gsk3β和β-catenin表達(dá)的影響，以進(jìn)一步闡明參芪苡術(shù)湯治療胃癌的科學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物血清制備 Wister大鼠，按大鼠每天劑量為1.8 g/100 g灌胃給參芪苡術(shù)湯，連續(xù)給藥5 d，制備空白血清和含藥血清，細(xì)胞培養(yǎng)將空白血清稀釋10倍，含藥血清分別稀釋5、10、15倍3個(gè)濃度進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，則每天的對(duì)應(yīng)劑量分別為3.6 g/100 g、1.8 g/100 g、0.9 g/100 g。

1.2 細(xì)胞來源 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人胃癌細(xì)胞SGC-7901，鹽城市中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫自己保存。實(shí)驗(yàn)所需儀器、試劑與耗材由鹽城市中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室及江蘇醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基（90%DMEM+10%胎牛血清）于37℃、5%CO2、20%O2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，取指數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞（100 mm培養(yǎng)皿），用吸慮泵吸去培養(yǎng)液。用PBS洗滌，加入0.25%胰蛋白酶，在37 ℃培養(yǎng)箱中消化1 min，后轉(zhuǎn)入10 mL的無菌離心管中離心，棄上清，加入凍存液，輕輕吹打使細(xì)胞重懸，然后凍存。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 在4 ℃下解凍Matrigel，過夜；在冷凍細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI1640）中（不含有血清）將Matrigel稀釋至5 mg/mL；把稀釋的基質(zhì)膠100 μL放入到24孔transwell的上室；37 ℃下孵育transwell 5 h，膠凝；用含1% FBS的培養(yǎng)基（RPMI1640）洗滌人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞，連續(xù)3次；重懸人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞到含有1%FBS的培養(yǎng)基中，密度106個(gè)/mL；用血清游離培養(yǎng)基洗滌凝膠基質(zhì)膠；將100 μL人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞懸浮液緩緩置于基質(zhì)膠上；把600 μL培養(yǎng)基（含有5 μg/mL纖連蛋白）填充到下腔室作為粘附性底物；于37 ℃下孵育24 h；從24孔板移除transwell，并染色；刮掉transwell頂部的未浸潤細(xì)胞；在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察并計(jì)數(shù)侵襲的細(xì)胞數(shù)。

1.5 Western Blot實(shí)驗(yàn) 用不同濃度參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清（每天0.9 g/100 g、每天1.8 g/100 g、每天3.6 g/100 g）處理細(xì)胞24 h，提取各組細(xì)胞總蛋白。用參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清處理 LICL處理過的24 h的人胃癌細(xì)胞SGC-7901 24 h，提取細(xì)胞總蛋白。BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞的蛋白濃度。分別取總蛋白15 μg上樣，經(jīng) 12%分離膠及5%濃縮膠SDSPAGE 凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn) PVDF 膜。加入特異性一抗4 ℃過夜與二抗室溫孵育2 h后，暗室中曝光和顯影，測(cè)定蛋白條帶的光密度值，以表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度參芪苡術(shù)湯（SQYZ）大鼠含藥血清對(duì)SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 實(shí)驗(yàn)分組分別為NaCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清（低）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清（中）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清（高）。各組胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清按每天0.9 g/100 g、每天1.8 g/100 g、每天3.6 g/100 g順序排列記為參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清（低）、參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清（中）、參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清（高）劑量組，下同。

結(jié)果顯示，LiCl刺激24 h后，可顯著改變SGC-7901的形態(tài)，由上皮型向間質(zhì)型轉(zhuǎn)化，低劑量參芪苡術(shù)湯含藥血清并不能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化趨勢(shì)，隨著含藥血清劑量增加，在中劑量和高劑量逐漸出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化被逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，從圖可以看出，中劑量和高劑量參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清處理后，上皮型細(xì)胞數(shù)目（所占比例）逐漸增多。見圖1。

圖1 不同濃度參芪苡術(shù)湯（SQYZ）大鼠含藥血清對(duì)SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

2.2 不同濃度參芪苡術(shù)湯（SQYZ）大鼠含藥血清對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲的影響 實(shí)驗(yàn)分組分別為NaCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清（低）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清（中）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清（高）。各組胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，采用Transwell實(shí)驗(yàn)方法觀察并計(jì)數(shù)各組胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目。

結(jié)果顯示，LiCl刺激24 h后，可顯著促進(jìn)SGC-7901的侵襲，穿過Transwell孔的細(xì)胞顯著增多，低劑量參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清并不能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞侵襲趨勢(shì)，隨著含藥血清劑量增加，在中劑量和高劑量逐漸出現(xiàn)侵襲被逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，中劑量和高劑量參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清處理后，穿過Transwell孔的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。見圖2。穿過Transwell孔的細(xì)胞定量的統(tǒng)計(jì)。見圖3。

2.3 不同濃度參芪苡術(shù)湯（SQYZ）大鼠含藥血清對(duì)SGC-7901細(xì)胞Wnt信號(hào)通路、EMT關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分組分別為NaCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術(shù)湯含藥血清（中）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術(shù)湯含藥血清（高）。各組胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，采用Western blot方法分別檢測(cè)p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白的表達(dá)情況。

圖2 不同濃度參芪苡術(shù)湯（SQYZ）大鼠含藥血清對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲影響

圖3 穿過Transwell孔的細(xì)胞定量統(tǒng)計(jì)

結(jié)果顯示，LiCl刺激4 h后，可激活SGC-7901的Wnt信號(hào)通路促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，可使其關(guān)鍵蛋白p-Gsk3β、β-catenin和Vimentin表達(dá)上調(diào)，中劑量和高參芪苡術(shù)湯含藥血清處理后，p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白表達(dá)明顯受到抑制，見圖4。對(duì)p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白表達(dá)半定量掃描的結(jié)果。見圖5。

圖4 不同濃度參芪苡術(shù)湯（SQYZ）大鼠含藥血清對(duì)SGC-7901細(xì)胞Wnt信號(hào)通路、EMT關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

圖5 p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白表達(dá)半定量結(jié)果

3 討論

已知上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有助于癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[2-5]。經(jīng)歷EMT的癌細(xì)胞可以獲得侵襲能力并進(jìn)入周圍組織，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的發(fā)生。在EMT的過程中，上皮細(xì)胞失去與它們的相鄰組織的接觸并獲得間質(zhì)性質(zhì)，使得它們能夠穿透基底膜得以轉(zhuǎn)移性傳播[6]。EMT的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）表達(dá)下調(diào)，間葉細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白（vimentin）表達(dá)上調(diào)。研究[7]表明腫瘤細(xì)胞具有EMT特征并且顯著增強(qiáng)侵襲能力，具有降低E-鈣粘蛋白水平和增高的波形蛋白，纖連蛋白，Twist和AKT2水平。轉(zhuǎn)移可能在很大程度上取決于癌細(xì)胞獲得EMT特征的能力[8-9]。研究[10]人員發(fā)現(xiàn)芍藥苷通過在缺氧條件下抑制EMT來阻斷乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Cui[11]推測(cè)天冬酰胺酰內(nèi)肽酶可以通過AKT和MAPK信號(hào)通路通過EMT促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，EMT的作用不僅包括增加遷移，侵襲能力和轉(zhuǎn)移潛力，而且還包括獲得化學(xué)耐藥性[12]。所以，EMT抑制劑的發(fā)展可能為預(yù)防和治療癌癥提供機(jī)會(huì)。

研究[13]表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在誘導(dǎo)胃癌EMT和侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究[14]觀察到Wnt-1和β-catenin在晚期胃癌患者的細(xì)胞中過表達(dá)。Wnt /β-catenin信號(hào)通路在癌癥中的作用通過Wnt穩(wěn)定β-catenin的能力達(dá)成，β-catenin是參與細(xì)胞與細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩個(gè)獨(dú)立過程的多功能蛋白[15]。在EMT過程中，β-catenin從E-鈣粘蛋白復(fù)合物釋放到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中與其它蛋白質(zhì)相互作用，提高β-catenin傳導(dǎo)增加了EMT發(fā)生的可能性[16]。此外，β-catenin可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，驅(qū)動(dòng)重要的細(xì)胞周期蛋白、癌基因和蛋白酶的表達(dá)，包括c-myc、MMP-7[17]和細(xì)胞周期蛋白D1[18]。Zhang等[19]報(bào)道，質(zhì)子泵抑制劑泮托拉唑可以通過抑制過度活化的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制胃癌細(xì)胞的化療耐藥和EMT，不僅說明經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)激活EMT和胃上皮細(xì)胞惡變，還證明了質(zhì)子泵抑制劑可以抑制胃癌的侵襲。

LiCl是當(dāng)前最常用的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路激活劑[20]。本研究發(fā)現(xiàn)LiCl刺激胃癌SGC-7901細(xì)胞后可以使Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白p-Gsk3β、β-catenin和EMT關(guān)鍵標(biāo)志物Vimentin表達(dá)上調(diào)，并在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)到明顯的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)變化，以及胃癌SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，參芪苡術(shù)湯大鼠含藥血清一定濃度下可以抑制LiCl刺激胃癌SGC-7901細(xì)胞后帶來的這些變化，我們推測(cè)參芪苡術(shù)湯可能抑制胃癌發(fā)生發(fā)展過程中Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的過度激活，并通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制胃癌發(fā)生發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移過程中的EMT，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。