高 歌，范義增，淡煒超，任加強(qiáng)，白欣姍，欒嘉欣，曾 津

(西安交通大學(xué)：1.第一附屬醫(yī)院泌尿外科；2.醫(yī)學(xué)部，陜西西安 710061)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年上升，位居我國男性惡性腫瘤的第6位[1]，在歐美等發(fā)達(dá)國家位居第1位[2]。前列腺癌生長具有雄激素依賴性，通過手術(shù)和藥物等方式阻斷雄激素對前列腺癌患者具有良好的治療效果，但大多數(shù)患者會從雄激素依賴型前列腺癌進(jìn)展為去勢抵抗型前列腺癌，侵襲性增加且預(yù)后極差。因此，繼續(xù)尋找新型有效的前列腺癌治療方式仍然是需要努力研究的方向。

水飛薊賓是從水飛薊種子中提取所得的活性成分[3-4]，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓可以作用于惡性腫瘤細(xì)胞增殖、能量代謝、血管生成和炎癥反應(yīng)等，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。我們研究團(tuán)隊前期發(fā)現(xiàn)水飛薊賓在抑制前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要功能[5-6]，然而對于水飛薊賓能否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERs)調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡尚未可知。本實(shí)驗(yàn)旨在探究水飛薊賓通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡，以期找到水飛薊賓治療前列腺癌的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、C4-2購自美國ATCC細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；水飛薊賓和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma-Aldrich公司；RNA提取試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；兔抗人Caspase 3/Cleaved-Caspase 3、Caspase 12/Cleaved-Caspase 12、BiP/GRP78抗體購自美國CST公司；兔抗人IRE-1和JNK購自美國abcam公司；β-ACTIN抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC-3、C4-2接種于含10%胎牛血清和雙抗溶液(青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL)的RPMI1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞呈貼壁生長，放置在37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每隔2～3 d細(xì)胞換液。當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%左右時，用0.05%胰酶消化，收集離心并重懸細(xì)胞，傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)收集對數(shù)生長期PC-3、C4-2細(xì)胞，按照細(xì)胞密度5×103個/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的水飛薊賓(0、25、50、75、100、125、150、175、200 μmol/L)處理細(xì)胞，每組設(shè)5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24/48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液后每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，490 nm波長處測定吸光度，計算細(xì)胞存活率。

1.4平板克隆實(shí)驗(yàn)收集對數(shù)生長期PC-3、C4-2細(xì)胞，以1 000個/孔的密度接種于6孔板中培養(yǎng)，分別加入不同濃度的水飛薊賓(0、100、150、200 μmol/L)，放置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1周。終止培養(yǎng)后使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS清洗3遍后加入0.1%結(jié)晶紫染色液染色20 min，緩慢沖洗洗去染色液，空氣干燥后用肉眼直接計數(shù)克隆，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5Westernblot分析前列腺癌細(xì)胞PC-3、C4-2接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的水飛薊賓(0、100、150、200 μmol/L)處理24 h，PBS緩沖液沖洗3次并收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液離心15 min，提取上清總蛋白。留取10 μL上清液進(jìn)行蛋白定量，其余上清加入6×Loading buffer在沸水中煮沸5 min。每組取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯胺凝膠電泳，蛋白分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h；加入一抗放置于4℃搖床過夜，次日TBST洗膜10 min×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記對應(yīng)二抗室溫孵育1 h， TBST洗膜3次，使用ECL進(jìn)行顯色，Image lab分析軟件對顯色條帶進(jìn)行分析。目的蛋白表達(dá)量通過與內(nèi)參蛋白β-ACTIN標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對比值。

2 結(jié) 果

2.1水飛薊賓對前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響前列腺癌細(xì)胞C4-2和PC-3接種于96孔板，使用不同濃度(0、25、50、75、100、125、150、175、200 μmol/L)水飛薊賓處理細(xì)胞24 h，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比水飛薊賓抑制C4-2(圖1A)和PC-3(圖1B)細(xì)胞增殖且呈濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。使用SPSS 18.0統(tǒng)計分析測得對C4-2和PC-3細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為112.484 μmol/L和139.501 μmol/L，依據(jù)IC50分別選擇50、100、150 μmol/L和100、150、200 μmol/L處理C4-2和PC-3細(xì)胞。

圖1不同濃度水飛薊賓處理前列腺癌細(xì)胞24h時MTT檢測C4-2及PC-3細(xì)胞存活率的變化

A：C4-2；B：PC-3。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(水飛薊賓抑制前列腺癌細(xì)胞增殖呈濃度依賴性)。

2.2水飛薊賓抑制前列腺癌細(xì)胞的平板克隆形成在MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水飛薊賓抑制前列腺癌細(xì)胞增殖活性后，我們又通過平板克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證水飛薊賓對于前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。分別使用0、50、100、150 μmol/L和0、100、150、200 μmol/L的水飛薊賓處理C4-2(圖2A、B)和PC-3(圖2C、D)細(xì)胞1周，與對照組相比，水飛薊賓處理組前列腺癌細(xì)胞克隆形成能力減弱，平板克隆細(xì)胞數(shù)目減少、體積減小，抑制作用與濃度呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度水飛薊賓對C4-2細(xì)胞及PC-3細(xì)胞克隆形成能力及數(shù)目

A：C4-2細(xì)胞克隆形成能力；B：C4-2細(xì)胞克隆形成數(shù)目；C：PC-3細(xì)胞克隆形成能力；D：PC-3細(xì)胞克隆形成數(shù)目。對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(水飛薊賓抑制前列腺癌細(xì)胞平板克隆形成)。

2.3水飛薊賓促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)組水飛薊賓處理前列腺癌細(xì)胞24 h，檢測Caspase 3/Cleaved-Caspase 3和Caspase 12/Cleaved-Caspase 12蛋白改變，與對照組相比水飛薊賓上調(diào)C4-2(圖3A、3B)和PC-3細(xì)胞(圖3C、D)Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 12蛋白水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3Western-blot檢測C4-2細(xì)胞、PC-3細(xì)胞中Caspase3/Cleaved-Caspase3和Caspase12/Cleaved-Caspase12蛋白表達(dá)改變及其柱狀圖(蛋白灰度值相對內(nèi)參比值變化)

A、B:分別為C4-2細(xì)胞蛋白表達(dá)改變的電泳圖及其柱狀圖；C、D：分別為PC-3細(xì)胞蛋白表達(dá)改變的電泳圖及其柱狀圖。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(水飛薊賓促進(jìn)Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 12表達(dá))。

2.4水飛薊賓激活前列腺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生本研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可以抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，但分子機(jī)制未知。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與增殖和凋亡之間存在密切聯(lián)系，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此我們猜想水飛薊賓通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程調(diào)節(jié)前列腺癌增殖和凋亡。使用不同濃度的水飛薊賓處理C4-2細(xì)胞及PC-3細(xì)胞24 h后，通過Western blot方法檢測C4-2細(xì)胞及PC-3細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白BiP、IRE1和JNK表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著水飛薊賓濃度的增加，C4-2細(xì)胞(圖4A、B)及PC-3細(xì)胞(圖4C、D)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白BiP、IRE1和JNK的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4Western-blot檢測C4-2細(xì)胞、PC-3細(xì)胞中BiP、IRE1和JNK蛋白水平變化及其柱狀圖(蛋白灰度值相對內(nèi)參比值變化)

A、B:分別為C4-2細(xì)胞蛋白表達(dá)改變的電泳圖及其柱狀圖；C、D：分別為PC-3細(xì)胞蛋白表達(dá)改變的電泳圖及其柱狀圖。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討 論

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，具有復(fù)雜的生物學(xué)行為。部分惡性程度低的前列腺癌患者可以長期帶瘤生存，而部分高度惡性的前列腺癌患者病情進(jìn)展迅速、發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移[8]。雄激素去勢治療(androgen deprivation therapy，ADT)是目前前列腺癌臨床最常用的治療手段之一，但大部分患者最終進(jìn)展為去勢抵抗性前列腺癌，因缺乏有效治療手段而最終死亡，平均生存期只有12～18月[9]。目前，雖然在全球范圍內(nèi)存在一些針對CRPC患者的治療藥物和措施，但其療效仍不理想。近年來我國前列腺癌的發(fā)病率逐漸升高，已經(jīng)成為威脅我國老年男性健康的重要?dú)⑹种弧?/p>

水飛薊素是從菊科植物水飛薊中提取出來的黃酮類化合物，其有效成分水飛薊賓具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗肝纖維化等多種作用[10]，是優(yōu)良的保肝類藥物。近年來，水飛薊賓在腫瘤中的作用越來越引起人們重視，研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓在乳腺癌[11]、肝癌[12]、腎癌[13]、膀胱癌[14]以及前列腺癌[15]等中發(fā)揮重要的抗癌作用。本研究重點(diǎn)探討水飛薊賓在前列腺癌中抑制增殖及促進(jìn)凋亡的作用，并探討其分子機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)通過使用不同濃度梯度水飛薊賓處理前列腺癌細(xì)胞C4-2和PC-3，使用MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其抑制前列腺癌增殖，并呈濃度依賴性。同時使用水飛薊賓處理細(xì)胞，通過Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3/Cleaved-Caspase 3、Caspase 12/Cleaved-Caspase 12表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度增加，Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 12表達(dá)上調(diào)，說明水飛薊賓促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡并呈濃度依賴性。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)作為真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，具有介導(dǎo)蛋白質(zhì)合成、成熟與分泌的重要功能。在多種條件下，如缺氧、饑餓、高脂飲食、鈣離子流失等會引起未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常生理功能的紊亂，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress，ERs)[16]。正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)來保護(hù)細(xì)胞免受ERs引起的損傷，然而當(dāng)嚴(yán)重或持續(xù)性ERs存在時，會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]。ERs主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白GRP78/BiP和3個應(yīng)激感受蛋白PERK、ATF6和IRE1所介導(dǎo)，ERs不存在的情況下分子伴侶GRP78/BiP與3個應(yīng)激感受蛋白結(jié)合，應(yīng)激感受蛋白處于失活狀態(tài)；當(dāng)ERs存在時，GRP78/BiP與3個應(yīng)激感受蛋白解離從而引起UPR發(fā)生。本研究使用不同濃度水飛薊賓處理細(xì)胞，通過Western blot檢測GRP78/BiP蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)水飛薊賓引起GRP78/BiP蛋白表達(dá)明顯升高。

IRE1是介導(dǎo)ERs和細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵的信號分子，通過激酶作用與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 2(TNF receptor associated factor,TRAF2)和凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(TNF-dependent apoptosis-signaling kinase 1，ASK1)形成TRAF2-ASK1-JNK 復(fù)合體，激活JNK信號通路，絲裂原活化蛋白激酶JNK通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[18]。在本研究中通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)隨著水飛薊賓藥物濃度增加，IRE1和JNK蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，這可能是水飛薊賓介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制。

綜上所述，水飛薊賓能夠明顯抑制前列腺細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡發(fā)生，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路是其可能的分子機(jī)制之一。