羊肉摻假鑒別快速熒光定量PCR芯片制備及應(yīng)用研究

李婷婷, 張桂蘭, 王之瑩, 陳愛(ài)亮

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所, 北京 100081

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提高，我國(guó)居民飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大的變化，火鍋、羊肉串等備受喜愛(ài)。然而，目前羊肉制品摻假現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重[1,2]，常見(jiàn)的摻假肉類(lèi)主要包括豬肉、雞肉、鴨肉等，有的甚至還會(huì)摻入鼠肉[3,4]。這種欺詐行為嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者權(quán)益，同時(shí)對(duì)社會(huì)發(fā)展帶來(lái)了消極影響。

目前，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種肉品摻假檢測(cè)技術(shù)[5]，主要包括以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附[6,7]、色譜質(zhì)譜技術(shù)[8～11]，以代謝物為基礎(chǔ)的紅外光譜技術(shù)[12]和以核酸為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)技術(shù)[13～17]等。其中，應(yīng)用最多的為基于熒光定量PCR的檢測(cè)技術(shù)，但是現(xiàn)有技術(shù)所需時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別的要求。同時(shí)，以羊肉串摻假為例，其摻假的肉類(lèi)品種可能有豬肉、雞肉、鴨肉、甚至老鼠肉等，如果逐個(gè)對(duì)可能的摻假物種進(jìn)行PCR檢測(cè)，則存在操作繁瑣、分析時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。

近年來(lái)，芯片式快速熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展為羊肉摻假鑒別等核酸檢測(cè)提供了一種快速、多重的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其是一種將芯片技術(shù)與熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合的高新生物技術(shù)[18～20]。傳統(tǒng)的微芯片技術(shù)是運(yùn)用微電機(jī)系統(tǒng)(micro-electro-mechanical system，MEMS)技術(shù)，通過(guò)制作微管道等空間結(jié)構(gòu)及微加熱等控制結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)芯片上的快速PCR擴(kuò)增[21]，而本研究通過(guò)將引物、反應(yīng)所需試劑預(yù)先凍干固定到芯片上，只需將模板滴加至微孔內(nèi)即可進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)利用微芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)現(xiàn)通過(guò)熒光信號(hào)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。該技術(shù)也可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)(植物病原菌檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因鑒別)、畜牧(牛類(lèi)病害鑒別、魚(yú)類(lèi)和家禽病原菌檢測(cè))、食品安全(病原菌鑒別、微生物腐敗鑒別)、生命科學(xué)和醫(yī)療(人類(lèi)疾病鑒別、人類(lèi)基因檢測(cè))等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉均購(gòu)自北京市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，鼠肉由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供。

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、海藻糖等均購(gòu)自北京雁棲灣生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；AriaDNA-10便攜式微芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LUMEX分析儀器公司)；NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；5424離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；MS 3渦旋儀(德國(guó)IKA公司)；KAPA SYBR?FAST Universal Kits(北京百諾威生物科技有限公司)；TIANamp Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 樣品制備

用電子天平稱(chēng)取羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鼠肉各20 mg，用于提取引物特異性實(shí)驗(yàn)所用模板。再按照不同重量百分比(表1)分別稱(chēng)取不同肌肉組織進(jìn)行混合，作為模擬摻假樣品(每份樣品為20 mg)，總摻假比例為0～80%。

表1 研究所用模擬摻假樣品Table 1 Simulated samples used in this study.

注：“-”表示該樣品不含此成分。

1.4 DNA的提取及檢測(cè)

按照TIANamp Genomic DNA Kit說(shuō)明書(shū)提取制備好的樣品的基因組DNA。采用超微量分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA進(jìn)行濃度及純度檢測(cè)。其濃度為10～20 ng/μL，且純度較高(A260/A280為1.8～1.9，A260/A230>2.0)，因此可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.5 引物特異性實(shí)驗(yàn)

研究所用引物均由北京生工生物技術(shù)有限公司合成，具體序列見(jiàn)表2。為了確定引物特異性，在ABI7500儀器上分別用羊源、豬源、雞源、鴨源與鼠源成分的特異性引物對(duì)5種肉的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，10 mol/L正、反向引物各0.4 μL，模板 2 μL，剩余用無(wú)菌去離子水補(bǔ)齊；反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 3 s，60℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min。添加熔解曲線。通過(guò)擴(kuò)增Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))來(lái)判斷引物的特異性，Ct<35為有效擴(kuò)增，Ct≥35為無(wú)效擴(kuò)增。

1.6 芯片式PCR

1.6.1芯片的制備 本研究的空芯片微陣列設(shè)計(jì)為5×6陣列，每個(gè)位點(diǎn)包含凍干固定的一對(duì)引物(表3)及反應(yīng)所需試劑。反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，10 mol/L正、反向引物各0.4 μL，剩余體積用無(wú)菌去離子水補(bǔ)齊，同時(shí)將5 μL 0.5 g/mL DMSO、1.65～1.95 mg保護(hù)劑BSA、0.6～1.2 mg賦型劑海藻糖與20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行混合。隨后取2 μL混合溶液滴加到芯片上，采用凍干機(jī)進(jìn)行凍干(-40℃，冷凍2 h)，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study.

表3 芯片中引物的位置(5×6)Table 3 The positions of primers in the chip (5×6).

1.6.2芯片式PCR反應(yīng) 將2 μL模擬摻假樣品1、2、3、4、5的基因組DNA分別滴加到芯片的第1、2、3、4、5列的反應(yīng)池內(nèi)，第6列為陰性對(duì)照，即不含任何模板。然后用640 μL礦物油將液體覆蓋，以免高溫蒸發(fā)，此方法無(wú)需繁瑣的配制體系與操作步驟，簡(jiǎn)單快速。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 3 s，60℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min。添加熔解曲線。

1.7 ABI7500熒光定量PCR

在ABI7500儀器上分別用羊源、豬源、鴨源、雞源與鼠源性成分的特異性引物對(duì)5種模擬摻假樣品的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，10 mol/L 正、反向引物各0.4 μL，模板2 μL，剩余體積用水補(bǔ)齊即可。反應(yīng)程序與芯片式PCR相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性實(shí)驗(yàn)

引物的特異性是動(dòng)物源性成分核酸檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵，本研究利用篩選出的羊源、豬源、鴨源、雞源與鼠源性成分的特異性引物對(duì)5種肉的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。

以羊源性引物為例(圖1A)，用羊源性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，除了羊源DNA出現(xiàn)擴(kuò)增且所對(duì)應(yīng)的熔解曲線均為單峰外，其他物種模板均無(wú)擴(kuò)增且熔解曲線為平滑的一條直線，說(shuō)明羊源性引物的特異性較好。豬源、雞源、鴨源與鼠源性引物與羊的結(jié)果一致，表明5對(duì)引物特異性好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 引物特異性實(shí)驗(yàn)Fig.1 The specificity of primers.A～E依次為羊源、豬源、雞源、鴨源、鼠源性成分的特異性引物分別對(duì)5種肉的基因組DNA擴(kuò)增后的結(jié)果。

2.2 自制多重PCR芯片檢測(cè)模擬羊肉摻假樣品結(jié)果

本研究利用自制的羊肉摻假鑒別多重PCR芯片以及AriaDNA-10便攜式微芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)5種模擬摻假樣品進(jìn)行檢測(cè)，各靶標(biāo)的擴(kuò)增Ct值見(jiàn)表4，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2。

根據(jù)5種模擬摻假樣品的成分配比可知，每個(gè)樣品中均含有羊源性成分，因此，采用羊源性引物對(duì)5種模擬摻假樣品進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，共5條擴(kuò)增曲線(圖2A)。同理，豬源、雞源、鴨源與鼠源性引物的位置分別出現(xiàn)4條、3條、2條與1條擴(kuò)增曲線，結(jié)果與已知樣品中所含成分保持一致。由于在實(shí)際應(yīng)用中若摻假比例太低，則獲利微薄，因此，本研究將最低摻假比例設(shè)為20%，未對(duì)含量更低的樣品進(jìn)行檢測(cè)。從圖2可以看出，利用自制的PCR芯片對(duì)5種模擬摻假樣品進(jìn)行檢測(cè)，均可檢測(cè)到相應(yīng)的動(dòng)物源性成分，定性檢測(cè)準(zhǔn)確率為100%，同時(shí)，擴(kuò)增曲線表明自制的PCR芯片具有較好的擴(kuò)增效率，而且隨著動(dòng)物源性成分含量的降低，相應(yīng)的Ct值逐漸增大。

表4 模擬羊肉摻假樣品的擴(kuò)增Ct值(Lumex)Table 4 The Ct values of simulated adulterated mutton samples(Lumex).

2.3 ABI7500熒光定量PCR驗(yàn)證及結(jié)果比對(duì)

采用ABI7500儀器對(duì)5種模擬摻假樣品進(jìn)行檢測(cè)，從而驗(yàn)證AriaDNA-10便攜式微芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的性能。各靶標(biāo)的擴(kuò)增Ct值見(jiàn)表5，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖3。

結(jié)合芯片式PCR和ABI7500熒光定量PCR的結(jié)果可知，本研究所建立的擴(kuò)增體系中，在AriaDNA-10儀器上用芯片進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增曲線不如ABI7500儀器顯示的曲線平滑，同時(shí)，從Ct值可以看出，采用ABI7500儀器進(jìn)行擴(kuò)增的Ct值均小于采用芯片進(jìn)行擴(kuò)增的Ct值，可能原因是芯片上的擴(kuò)增體系相對(duì)較少,導(dǎo)致達(dá)到閾值的時(shí)間偏后，因此，采用芯片進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)效率偏低。但是總體來(lái)說(shuō)，2種PCR檢測(cè)方法的結(jié)果一致，2種方法均能準(zhǔn)確的檢測(cè)出5種成分，且隨著動(dòng)物源性成分含量的減少，相應(yīng)的Ct值會(huì)逐漸增加。需要注意的是，本研究無(wú)法通過(guò)Ct值進(jìn)行定量檢測(cè)，只能進(jìn)行定性檢測(cè)，即確定含有哪種成分的摻假。

圖2 Lumex儀器對(duì)不同樣品進(jìn)行擴(kuò)增的曲線圖Fig.2 The fluorescent amplification curves of the different samples by Lumex.A～E依次為羊源、豬源、雞源、鴨源和鼠源性成分的特異性引物對(duì)5種模擬摻假樣品擴(kuò)增后的結(jié)果。

表5 模擬羊肉摻假樣品擴(kuò)增Ct值(ABI7500)Table 5 The Ct values of simulated adulterated mutton samples(ABI7500).

圖3 ABI7500對(duì)不同樣品進(jìn)行擴(kuò)增的曲線圖Fig.3 The fluorescent amplification curves of the different samples by ABI7500.A～E依次為羊源、豬源、雞源、鴨源和鼠源性成分的特異性引物對(duì)5種模擬摻假樣品擴(kuò)增后的結(jié)果。

3 討論

本研究建立了基于芯片的快速熒光定量PCR檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)的熒光定量PCR相比， PCR芯片一般由5×4或更多的反應(yīng)池組成，可實(shí)現(xiàn)樣品多指標(biāo)的檢測(cè)；由于芯片式PCR預(yù)先將反應(yīng)所需試劑和引物凍干保存，只需將提取的DNA模板滴加到芯片上即可進(jìn)行擴(kuò)增，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟、縮短了檢測(cè)時(shí)間。通過(guò)與ABI7500熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)果具有一致性，均可準(zhǔn)確的檢測(cè)出5種成分，且Ct值均隨著動(dòng)物源性成分比例的減少而升高。

目前，已有很多關(guān)于利用PCR技術(shù)檢測(cè)肉制品中摻假成分的報(bào)道[27～29]。Prusakova等[30]采用多重PCR擴(kuò)增法，可同時(shí)鑒別肉類(lèi)產(chǎn)品中5種常見(jiàn)的摻假肉類(lèi)，每種肉類(lèi)的檢測(cè)靈敏度可達(dá)30 pg。Dalsecco等[31]采用熒光定量PCR的方法，可以檢測(cè)10種不同的動(dòng)物源性成分；利用該方法對(duì)46種實(shí)驗(yàn)肉品混合物進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示所有品種均鑒定正確，檢測(cè)靈敏度為1%；同時(shí)對(duì)14種商業(yè)的肉類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行分析，結(jié)果表明14個(gè)樣品中有6個(gè)含有雞肉原料，由此可知，該方法對(duì)肉類(lèi)產(chǎn)品的分析是有效和可靠的。普通PCR雖然操作簡(jiǎn)單、成本較低，但是對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)，而傳統(tǒng)的熒光定量PCR一般需要2 h才能完成，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本研究所建立的芯片式熒光定量PCR擴(kuò)增法，由于所需樣本體積小(只需2 μL)，PCR升降溫反應(yīng)速度快，可縮短至30 min完成擴(kuò)增及數(shù)據(jù)收集，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短。該芯片的研制及快速檢測(cè)方法的建立將有效的簡(jiǎn)化羊肉制品摻假檢測(cè)的步驟、縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)所用芯片檢測(cè)儀器Lumex體積較小，攜帶方便，為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。

本研究雖然可以在30 min內(nèi)完成擴(kuò)增及數(shù)據(jù)收集，但是要建立一種快速檢測(cè)體系，DNA提取也需快速進(jìn)行，目前雖然已經(jīng)有相關(guān)的快速提取DNA試劑盒，但大多數(shù)為磁珠法，需要進(jìn)行細(xì)胞裂解、去除蛋白質(zhì)等步驟，操作繁瑣，而PCR技術(shù)是一項(xiàng)非常靈敏的分子檢測(cè)技術(shù)，擴(kuò)增效率高，只需痕量DNA即可檢測(cè)。因此，本課題組開(kāi)發(fā)了一種粗提DNA技術(shù)[32]，在5 min內(nèi)即可提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間，為羊肉制品安全監(jiān)測(cè)、摻假監(jiān)管提供了理想的技術(shù)手段及方法。未來(lái)，如何將DNA提取、特異片段擴(kuò)增和數(shù)據(jù)收集整合為一體化的檢測(cè)方法仍需進(jìn)一步探索。