百草枯急性暴露對(duì)肝細(xì)胞L-O2的毒理研究

許夢(mèng)川，談?dòng)?，李小滿，李前,*，吳躍峰，李東明,#

1. 河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北省動(dòng)物生理生化與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050024 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所 抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850

百草枯(paraquat, PQ)，其化學(xué)名稱1,1-二甲基-4,4-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，是目前世界上使用最廣泛的除草農(nóng)藥之一[1]。百草枯對(duì)人毒性極大，且無(wú)特效解毒藥，已被20多個(gè)國(guó)家禁止或者嚴(yán)格限制使用，中國(guó)也自2016年7月1日起停止水劑在國(guó)內(nèi)的銷售和使用，但仍有大量的百草枯偽裝成其他農(nóng)藥身份再次出現(xiàn)在市場(chǎng)上。PQ可經(jīng)吸入、吞食和皮膚接觸等途徑對(duì)人和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重的危害。大量研究表明，PQ還能增加患帕金森病(PD)的風(fēng)險(xiǎn)，而PD僅次于阿爾茨海默病(AD)已成為老年人患病中的第二大常見(jiàn)神經(jīng)退行性疾病[2]。此外，由于PQ具有較長(zhǎng)的半衰期，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中殘余的PQ通過(guò)植物葉子進(jìn)入食物中，或通過(guò)滲入地下污染水環(huán)境進(jìn)而間接危害人和動(dòng)物的健康[2]。

在過(guò)去40年中，研究大多認(rèn)為PQ的毒理作用機(jī)制主要是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的脂質(zhì)過(guò)氧化，蛋白損傷以及DNA斷裂等削弱組織和細(xì)胞功能[3]，同時(shí)引發(fā)炎性因子免疫風(fēng)暴，最終導(dǎo)致人肺纖維化，并伴有肝損傷、腎衰竭等[4]?；钚匝?ROS)在胞內(nèi)的大量積累是氧化應(yīng)激的主要體現(xiàn)，ROS的過(guò)量表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞氧化損傷、周期阻斷以及細(xì)胞凋亡[5]。盡管這些年對(duì)于PQ的機(jī)制研究主要集中在肺損傷，但肝臟作為機(jī)體最大的解毒器官，也不可避免地會(huì)受到PQ的毒害作用，研究肝臟損傷及其毒理作用具有重要意義。本研究以肝細(xì)胞L-O2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，從細(xì)胞水平評(píng)價(jià)PQ對(duì)肝細(xì)胞的毒理影響，并探討其可能的毒理機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑和儀器

主要試劑：正常人肝細(xì)胞系L-O2，購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；百草枯(Paraquat，純度100%，分子量257.16)，購(gòu)自美國(guó)AccuStandard公司；CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、活性氧ROS分析試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；PMSF購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；Trizol裂解液和UItraECL底物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自博邁德生物技術(shù)有限公司；兔抗caspase-9抗體、兔抗Bcl-2抗體、兔抗Bax抗體、兔抗β-Actin抗體以及辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購(gòu)自武漢博士德公司；總RNA提取試劑盒、TIANScriptⅡcDNA第一鏈合成試劑盒和SuperReal熒光定量預(yù)染試劑均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、Φ60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自美國(guó)Corning公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：多功能酶標(biāo)儀SpectraMax M5(美國(guó)Molecular Devices公司)；DYCP-40C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀Image Quant LAS500(美國(guó)GE公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱Thermo Scientific 3111(美國(guó)Thermo公司)；流式細(xì)胞儀FACSCalibur(美國(guó)BD公司)；倒置顯微鏡Nikon eclipse TE300(日本Nikon公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀LightCycler?96(瑞士Roche公司)。

1.2 L-O2細(xì)胞培養(yǎng)

L-O2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和1×105U·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，接種密度2×108L-1，23 d換液，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%左右進(jìn)行傳代。

1.3 CCK-8法檢測(cè)L-O2細(xì)胞存活率

CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測(cè)細(xì)胞增殖-毒性快速靈敏，是MTT法的升級(jí)版。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-O2細(xì)胞，于96孔板中接種1×108L-1細(xì)胞100 μL，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，用0、40、80、160、320、480和640 μmol·L-1的PQ溶液作用L-O2細(xì)胞，每組6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)3個(gè)不加細(xì)胞的空白對(duì)照孔。24 h后各孔加入10 μL CCK-8檢測(cè)液，37 ℃孵育1 h。多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率，并確定半抑制濃度(IC50)。

1.4 DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)ROS

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-O2細(xì)胞，于Φ60 mm培養(yǎng)皿接種3×108L-1的細(xì)胞3 mL，各組設(shè)3復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，加入0、60、120、180、250 μmol·L-1的PQ溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞1次，按照試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書操作加入濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA(2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽)熒光探針加載工作液，37 ℃孵育30 min，棄加載液，用PBS洗細(xì)胞2次并重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS。

1.5 PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期

Φ60 mm培養(yǎng)皿中接種3×108L-1的細(xì)胞3 mL，各組設(shè)3復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，用0、60、120、180、250 μmol·L-1的PQ溶液處理細(xì)胞24 h。胰酶消化細(xì)胞后，加入1 mL預(yù)冷的70%的乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃放置1224 h。離心去上清，PBS洗細(xì)胞1次，加入500 μL的碘化丙啶(PI)染色工作液后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)L-O2細(xì)胞周期變化情況[6]。

1.6 AnnexinV-FITC染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

Φ60 mm培養(yǎng)皿中接種3×108L-1的細(xì)胞3 mL，各組設(shè)3復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度的PQ溶液繼續(xù)作用24 h。將各組上清液和胰酶消化后的細(xì)胞，一并轉(zhuǎn)入收集管中，400×g離心5 min，棄上清。PBS洗細(xì)胞1次，按照試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書操作用500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞并加入5 μL Annexin V-FITC結(jié)合物，混勻后再加入5 μL的PI Solution，室溫下避光反應(yīng)15 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)L-O2細(xì)胞的凋亡情況。

1.7 Western蛋白印跡法檢測(cè)活化的caspase-9、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)

T25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種3×108L-1的細(xì)胞5 mL，培養(yǎng)24 h后，換用0、60、120、180、250 μmol·L-1的PQ溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用Western及IP細(xì)胞裂解液(使用前加入終濃度為1 mmol·L-1的PMSF)裂解各組細(xì)胞，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白上樣量為30 μg，將凝膠于電泳儀上半干轉(zhuǎn)2 h至PVDF膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗兔抗caspase-9(1:400)、兔抗Bcl-2(1:400)、兔抗Bax(1:400)以及兔抗β-Actin(1:400)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，次日0.1%TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗羊抗兔IgG-HRP抗體(1:5 000)，室溫?fù)u床孵育1 h，0.1%TBST洗膜3次，每次10 min。最后將ECL底物化學(xué)發(fā)光液浸濕膜，并進(jìn)行曝光顯影，利用image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

T25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種3×108L-1的細(xì)胞5 mL，培養(yǎng)24 h后，用0、60、120、180、250 μmol·L-1的PQ溶液繼續(xù)處理24 h。按照試劑盒說(shuō)明書操作，Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)碳酸酐酶9(CA9)基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物：CA9正義Forward為5’-GGATCTACCTACTGTTGAGGCT-3’，反義Reverse為5’-CATAGCGCCAATGACTCTGGT-3’；β-actin正義Forward為5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，反義Reverse為5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性條件為95 ℃、15 min；兩步法反應(yīng)條件為95 ℃、10 s，60 ℃、32 s，共40個(gè)循環(huán)。目的基因mRNA表達(dá)用β-actin基因均一化處理，基因表達(dá)變化通過(guò)2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

圖1 不同濃度百草枯(PQ)暴露對(duì)L-O2細(xì)胞存活率的影響注： P<0.01，與對(duì)照組相比。Fig. 1 Effect of paraquat (PQ) on L-O2 hepatocytes viabilityNote: n=3; **P<0.01, compared with the control.

圖2 不同濃度PQ暴露對(duì)ROS水平的影響注：A圖為細(xì)胞流式圖；B圖為對(duì)圖A進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；與對(duì)照組比較。Fig. 2 Effect of PQ on intracellular reactive oxygen species (ROS) levels of L-O2 hepatocytesNote: A, representative data of flow cytometric analysis; B, the quantification of A; n=3; ** P<0.01, compared with the control.

圖3 不同濃度PQ對(duì)細(xì)胞周期的影響注：A圖為細(xì)胞流式圖；B圖為對(duì)圖A進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；與對(duì)照組比較。Fig. 3 Effect of PQ on cell cycle of L-O2 hepatocytesNote: A, representative data of flow cytometric analysis; B, the quantification of A. n=3; * P<0.05, ** P<0.01, compared with the control.

2 結(jié)果(Results)

2.1 PQ對(duì)L-O2細(xì)胞存活率的影響

用0、40、80、160、320、480和640 μmol·L-1不同濃度PQ溶液作用L-O2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率隨PQ濃度的升高而降低(圖1)。采用Logit法計(jì)算細(xì)胞存活的IC50為263.2 μmol·L-1，95%置信限為246.2281.4 μmol·L-1。

2.2 PQ對(duì)L-O2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

用0、60、120、180、250 μmol·L-1的PQ溶液作用L-O2細(xì)胞24 h，L-O2細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS隨著PQ濃度的升高而增加，并顯著高于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.01) (圖2)。

2.3 PQ對(duì)L-O2細(xì)胞周期的影響

在不同濃度的PQ溶液作用L-O2細(xì)胞24 h后，120、180、250 μmol·L-1組L-O2細(xì)胞周期的S期所占周期比例顯著升高(P<0.05，P<0.01)；相應(yīng)的各組細(xì)胞周期的G2-M期時(shí)段顯著降低(P<0.01)(圖3)。隨著PQ濃度的升高，S期逐漸出現(xiàn)周期阻滯，提示PQ作用細(xì)胞后對(duì)DNA復(fù)制產(chǎn)生影響，造成合成受阻。

2.4 PQ對(duì)L-O2細(xì)胞凋亡的影響

用120、180、250 μmol·L-1的PQ溶液作用L-O2細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率依次為15.85%±5.18%、25.25%±2.94%和36.41%±4.68%，均顯著高于細(xì)胞對(duì)照組5.44%±1.64%(P<0.05，P<0.01)，而低濃度組60 μmol·L-1組的凋亡率10.95%±3.19%無(wú)顯著差異性(圖4)。

2.5 PQ對(duì)L-O2細(xì)胞中casepase-9、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，PQ作用24 h后，120、180、250 μmol·L-1組caspase-9的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05，P<0.01)，各組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比值明顯增大(圖5)。

2.6 PQ對(duì)CA9 mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，120、180、250 μmol·L-1組CA9 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05，P<0.01)(圖6)，值得注意的是250 μmol·L-1組CA9的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的29倍，提示在短時(shí)間高濃度的PQ暴露下，該基因在細(xì)胞應(yīng)激中可能發(fā)揮著重要作用。

圖4 不同濃度PQ對(duì)細(xì)胞凋亡的影響注：A圖為細(xì)胞流式圖；B圖為對(duì)圖A進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；與對(duì)照組比較。Fig. 4 Effect of PQ on apoptosis of L-O2 hepatocytesNote: A, representative data of flow cytometric analysis; B, the quantification of A; n=3; * P<0.05, ** P<0.01, compared with the control.

圖5 不同濃度PQ對(duì)肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響注：A圖為凋亡蛋白的Western blot分析結(jié)果；B圖為凋亡蛋白的相對(duì)表達(dá)量；與對(duì)照組比較。Fig. 5 Effect of PQ on protein expression of caspase 9, Bcl-2 and Bax by western blottingNote: A, western blot analysis of protein; B, the semi-quantitative result of A. n=3; * P<0.05, ** P<0.01, compared with the control.

圖6 不同濃度PQ對(duì)CA9 mRNA表達(dá)的影響注：與對(duì)照組比較。Fig. 6 Effect of PQ on mRNA expression of CA9 in L-O2 hepatocytesNote: n=3; * P<0.05, ** P<0.01, compared with the control.

3 討論(Discussion)

本研究表明，PQ對(duì)正常人肝細(xì)胞L-O2具有明顯的毒害作用。研究通過(guò)CCK-8法確定PQ作用24 h的IC50為263.2 μmol·L-1，根據(jù)此結(jié)果選擇約1/4 IC50、1/2 IC50、2/3 IC50以及1IC50即60、120、180和250 μmol·L-1作為研究PQ對(duì)L-O2細(xì)胞毒害作用的濃度。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示PQ可造成胞內(nèi)ROS升高，DNA復(fù)制受阻進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡，凋亡相關(guān)蛋白的變化提示其凋亡機(jī)制可能與內(nèi)源性線粒體途徑的激活有關(guān)。此外，與調(diào)控酸堿平衡相關(guān)的CA9的高效表達(dá)體現(xiàn)PQ對(duì)細(xì)胞的酸毒害。

近年來(lái)有關(guān)PQ的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，PQ作用人肝癌細(xì)胞HepG2 24 h的IC50為57.17 mg·mL-1[7]即222.3 μmol·L-1；1.6 mmol·L-1的PQ溶液作用人近端腎小管細(xì)胞HK-2 24 h的細(xì)胞存活率為64.4%[8]，而100 μmol·L-1的PQ溶液作用神經(jīng)細(xì)胞PC12 48 h就可使80%的細(xì)胞死亡[9]。本研究通過(guò)CCK-8法測(cè)得PQ作用肝細(xì)胞L-O2 24 h的IC50為263.2 μmol·L-1，可認(rèn)為PQ對(duì)正常肝細(xì)胞的毒害作用與肝癌細(xì)胞相似，差別造成的原因可能與細(xì)胞代謝方式以及細(xì)胞狀態(tài)不同有關(guān)。此外，機(jī)體不同組織和器官對(duì)PQ的耐受程度不同，并根據(jù)毒性作用時(shí)間越長(zhǎng)IC50值越低的原則，可認(rèn)為腎臟細(xì)胞較肝臟細(xì)胞的毒性耐受力強(qiáng)，而神經(jīng)細(xì)胞最敏感。根據(jù)測(cè)定的IC50值，設(shè)定一系列的不同處理濃度(60、120、180和250 μmol·L-1)，并使最高PQ作用濃度稍低于IC50值。如此既保證了明顯毒性的存在，又保證了有一半以上的細(xì)胞存活，有利于實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。

有研究認(rèn)為，PQ一旦進(jìn)入細(xì)胞，就會(huì)通過(guò)其季銨態(tài)氮原子和聯(lián)吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)以循環(huán)單電子形式參與線粒體氧化還原體系，產(chǎn)生大量的ROS[8]。胞內(nèi)ROS的大量累積直接造成細(xì)胞和組織的氧化應(yīng)激損傷[10]，同時(shí)ROS還會(huì)激活下游炎癥相關(guān)信號(hào)通路[11]，ROS被認(rèn)為是造成急性肺損傷的主要原因。本研究中PQ暴露濃度為60 μmol·L-1時(shí)就可使L-O2細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，并且隨著PQ暴露濃度的增加而不斷累積，而實(shí)際上ROS的過(guò)量表達(dá)會(huì)直接引發(fā)細(xì)胞凋亡。于是我們檢測(cè)了PQ作用后的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示隨著PQ濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，并與胞內(nèi)不斷累積的ROS成正相關(guān)，但60 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異性，而ROS水平在此濃度時(shí)卻表現(xiàn)出差異性，提示ROS的產(chǎn)生早于細(xì)胞凋亡，ROS在胞內(nèi)的累積可能是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的直接原因。此外，細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果顯示，PQ作用后從120 μmol·L-1組起S期開(kāi)始出現(xiàn)明顯阻滯，而相應(yīng)的G2-M期所占周期比例下降，提示PQ作用后對(duì)DNA復(fù)制產(chǎn)生了影響，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖的順利進(jìn)行?；赑Q毒性機(jī)制與氧化應(yīng)激相聯(lián)系，在PQ作用于人近端腎小管細(xì)胞HK-2研究中，PQ可導(dǎo)致線粒體損傷進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡[8]；在人神經(jīng)前導(dǎo)細(xì)胞(hNPCs)的PQ毒性研究中，胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)水平升高，ROS顯著升高，細(xì)胞周期和凋亡調(diào)控基因p21和p53 mRNA表達(dá)上調(diào)[12]。本研究結(jié)果與以上結(jié)果具有一致性。

線粒體內(nèi)源性途徑是細(xì)胞凋亡的主要方式之一，而該途徑的實(shí)現(xiàn)依賴于受Bcl-2(the B-cell lymphoma gene2)蛋白家族調(diào)控的線粒體外膜通透性的改變[13]。Bcl-2蛋白家族成員主要由抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1)和促凋亡蛋白(Bax、Bak、Bad、Bid、Bik、Bim)組成[13]。當(dāng)促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降時(shí)，線粒體外膜通透性發(fā)生改變，致使線粒體內(nèi)的凋亡因子如Cyt c等釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，進(jìn)而激活casepase-9，活化的casepase-9再進(jìn)一步激活casepase-7和casepase-3，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡[14]，稱為內(nèi)源性線粒體凋亡途徑[15]。在肝細(xì)胞以往的研究中，丹酚酸緩解TNF-(腫瘤壞死因子)介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑可通過(guò)改變Bax/Bcl-2的比值實(shí)現(xiàn)[16]。葡多酚可通過(guò)抑制Bcl-2水平的降低進(jìn)而抑制乙醇誘發(fā)的小鼠肝細(xì)胞增殖活性損傷[17]。本研究Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Bax和Bcl-2的比值隨著PQ暴露濃度的增加而增大，并且casepase-9的蛋白表達(dá)也出現(xiàn)顯著上調(diào)，提示PQ作用后線粒體外膜通透性發(fā)生改變，致使凋亡因子外漏，并在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中激活casepase-9，進(jìn)而激活內(nèi)源性線粒體凋亡途徑。該結(jié)果與微囊藻毒素-LR通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，檢測(cè)的細(xì)胞凋亡率升高，線粒體跨膜通透性改變，同時(shí)caspase-3和caspase-9相對(duì)表達(dá)量升高[18]。

CA9是一種跨膜的鋅金屬酶，催化二氧化碳生成碳酸的可逆水化過(guò)程[19]，通過(guò)調(diào)控pH值維持細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡，對(duì)于細(xì)胞的代謝和生存具有重要意義。CA9通常多表達(dá)在腫瘤細(xì)胞(如乳腺癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、鼻咽癌等)[20]，而在正常細(xì)胞中表達(dá)很少，可由低氧HIF-1途徑激活[21]，通過(guò)升高pH值減輕Warburg效應(yīng)造成的酸毒害，進(jìn)而有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲[22]。本研究發(fā)現(xiàn)PQ作用后，高濃度組CA9高效表達(dá)，提示PQ暴露下可能引起酸性代謝產(chǎn)物出現(xiàn)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生酸毒害，但其內(nèi)在的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。