劉敏楠

(謝菲爾德大學(xué),英國 S10 2TN)

消渴靈片是臨床常用的消渴病治療藥物,具有氣陰雙補(bǔ)、清熱止渴功效,適用于消渴病氣陰兩虛型,典型臨床表現(xiàn)包括多飲多食多尿、體重下降,氣短,全身乏力?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)中并無消渴病名,根據(jù)病因病機(jī)及臨床表現(xiàn)可歸屬于“糖尿病”,多屬于2型糖尿病[1-2]。黃連是消渴靈片組方中不可或缺的組成部分,其主要有效成分是鹽酸小檗堿,即通常意義上的黃連素,具有清熱瀉火、止渴燥濕的功效[3]。鹽酸小檗堿屬于一種生物堿,具有抑菌作用,能夠有效清除毒素[4]。本次研究選擇Dionex Ultimate3000型色譜儀,分別選擇Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色譜柱,經(jīng)由體積排阻色譜法進(jìn)行檢測,分析檢測結(jié)果,獲得一定研究成果,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 設(shè)備與試劑

本次研究選擇Dionex Ultimate3000(Thermo Scientific制造)型色譜儀,分別選擇Acclaim SEC-300(5μm,分析范圍4.6×300mm,由Thermo Scientific制造)及MAbPac SEC-1色譜柱(5μm,分析范圍2.1×300mm,由Thermo Scientific制造),濃度測量儀器為Nanodrop2000(Thermo Scientific制造),離心機(jī)為Thermo Legend Micro17離心機(jī),20μL環(huán)形Nano Viper/彩色PEEK管(內(nèi)部直徑為0.18mm),震蕩攪拌機(jī),Mettler toledo 320 pH計(jì);主要化學(xué)試劑如下：HPLC梯度級水(Fisher Scientific制造,英國),HPLC級乙腈(Fisher Scientific制造,英國),P4417 SIGMA磷酸鹽緩沖鹽水(片劑,一片溶于200mlHPLC水中,得到0.01M磷酸鹽緩沖液);鹽酸小檗堿(產(chǎn)品編號GZDD-0060,CAS號633-65-8,質(zhì)地純度≥98.837%,來自貴州迪大科技有限責(zé)任公司,常規(guī)包裝30mg),消渴靈片(國藥準(zhǔn)字Z22023834,由四平市吉特藥業(yè)有限公司生產(chǎn),0.36g/片)。

1.2 方法

本次研究選擇Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色譜柱,其直徑分別為4.6×300mm、2.1×30mm,流速分別為≤0.35ml/min、0.05-0.075ml/min,柱溫分別為＜60℃、20-25℃,pH范圍分別為2-12、2.5-7.5,流量參數(shù)分別0.3ml/min、0.075ml/min,平衡時間分別為50min、42min;給予HPLC級乙腈、HPLC梯度級水以及P4417SIGMA磷酸鹽緩沖鹽水(0.01M),檢測波長260nm,經(jīng)由體積排阻色譜法進(jìn)行檢測,分析檢測結(jié)果。檢測方法如下：(1)吸取HPLC梯度級水(5μL)轉(zhuǎn)移至設(shè)備頂部,合上裝置臂,再次打開后,擦拭頂部HPL C梯度級水,重復(fù)2-5次,保證設(shè)備頂部足夠干凈。(2)進(jìn)入系統(tǒng)設(shè)置后,選擇計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中的寡核苷酸計(jì)算模式,輸入序列后,得到分子量及分子退出系數(shù)等實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)參數(shù);(3)測試鹽酸小檗堿樣品前,以2μL HPLC梯度水作為實(shí)驗(yàn)的空白對照組,開始樣品濃度測試,每次吸取樣品2 μL;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,儀器頂部同樣使用HPLC梯度級水清洗;準(zhǔn)備好樣品(單個樣品總體積500 μl,最大濃度400pmol/μl)、制備緩沖液,設(shè)定濃度為5pmol/μl;-20℃條件下保存于冰凍箱內(nèi);檢測時,將樣本取出后放置于室溫下,直至樣品完全融化后,經(jīng)渦旋混合器混合、經(jīng)離心5min后,去除氣泡,再繼續(xù)其余實(shí)驗(yàn)步驟;層析寡核苷酸樣品,自動取樣針依次吸取P BS緩沖液、鹽酸小檗堿樣品、P BS緩沖液;每個緩沖液均需在脫氣15min后再與色譜系統(tǒng)相連,在實(shí)驗(yàn)中持續(xù)關(guān)注P B S緩沖液情況,P B S緩沖液需及時更換,但不得中斷,保證色譜柱不干燥。

2 結(jié)果

鹽酸小檗堿在40.371-215.109pmol/μL濃度范圍內(nèi)與峰高之間存在線性關(guān)系,R2=0.9302,方程y=5.069x-14.172。

3 討論

3.1 消渴靈片與鹽酸小檗堿

消渴靈片主要組成部分包括人參、黃芪、枸杞、五倍子、葛根、知母等諸中藥,其主要臨床表現(xiàn)多為全身乏力,多飲多食多尿等[5]。消渴病在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中并無此病名,而是根據(jù)其病因病機(jī)及臨床表現(xiàn)歸屬于糖尿病。而糖尿病是臨床常見的慢性內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,以持續(xù)高血糖為主要臨床表現(xiàn),多經(jīng)藥物治療,代表藥物包括二甲雙胍、胰島素、格列齊特等,能夠有效降低血糖,有助于減輕患者糖耐量受損程度。黃連是消渴靈組方中的君藥,其主要有效成分是指鹽酸小檗堿,具有抗炎、抑菌等功效[6]。由于鹽酸小檗堿具有清熱、解毒、抗炎止血等作用,與治療氣陰兩虛型消渴病的消渴靈片功效關(guān)聯(lián)密切,因此將鹽酸小檗堿作為評估消渴靈片質(zhì)量的重要控制指標(biāo)非常合理,具有非常重要的臨床意義。

3.2 高效液相色譜法與樣本檢測

鹽酸小檗堿多用于霍亂弧菌屬細(xì)菌、志賀菌屬細(xì)菌等致病菌導(dǎo)致的感染性腸道疾病,其檢測方法較多,如紫外-可見分光光度法、二階導(dǎo)數(shù)光譜法、薄層掃描法及高效液相色譜法等,其中以高效液相色譜法應(yīng)用率最高,該方法具有重復(fù)性好、層析速度快、分離效率高、特異性較好等優(yōu)勢,在藥物分析中應(yīng)用范圍廣泛。本次研究中以消渴靈片為鹽酸小檗堿樣本來源,制定樣品及緩沖液后,經(jīng)由體積排阻色譜法進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示：本次研究樣品的鹽酸小檗堿在40.371-215.109pmol/μL濃度范圍內(nèi)與峰高之間存在良好的線性關(guān)系,R2=0.9302,方程y=5.069x-14.172。

4 結(jié)語

總之,采用高效液相色譜法檢測鹽酸小檗堿,具有線性關(guān)系良好、操作便捷、準(zhǔn)確等優(yōu)勢,有助于控制消渴靈片質(zhì)量,值得進(jìn)一步在臨床應(yīng)用及推廣。

[1] 薛非凡,曾麗,王麗玉,等.消渴靈片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥師,2013,16(11)：1641-1644.

[2] 蔣叔霏.高效液相色譜法測定消渴靈片中鹽酸小檗堿含量[J].安徽醫(yī)藥,2012,16(6)：766-767.

[3] 楊冬梅,張毅,劉俊,等.不同溶媒在不同提取方法下對吳茱萸堿提取率的影響[J].安徽醫(yī)藥,2012,16(6)：765-766.

[4] 董海彥.連蒲雙清片含量均勻度的考察[J].華西藥學(xué)雜志,2014,29(4)：478-479.

[5] 趙嚴(yán)麗,陳淑娟.高效液相色譜法測定消渴平膠囊中鹽酸小檗堿含量[J].中國藥業(yè),2014,23(1)：10-11.

[6] 魏世超,徐麗君,鄒欣,等.黃連粉末中鹽酸小檗堿及鹽酸藥根堿的體內(nèi)腸吸收特性[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,42(3)：333-337.