超聲處理對蛋清粉速溶性的影響

孫 卓，李佩珊，盛 龍，馬美湖，金永國*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

雞蛋是日常生活中一種常見的蛋白質(zhì)源食物，包括人體需要的8 種必需氨基酸，易被人體消化和吸收，消化率高達98%，位于食源蛋白質(zhì)的第一位[1]。雞蛋清是包裹在蛋黃周圍的由蛋白質(zhì)組成的透明淡黃色膠狀物質(zhì)，約占雞蛋總質(zhì)量的60%[2]，其中蛋白質(zhì)占蛋清質(zhì)量的11%～13%。雞蛋營養(yǎng)成分全面，烹飪方法多樣，易被消化吸收，且產(chǎn)量豐富，因此蛋制品的研究已有上百年的歷史。傳統(tǒng)的蛋制品包括咸蛋、皮蛋、雞蛋干等產(chǎn)品，現(xiàn)在越來越多的企業(yè)開始對雞蛋進行深加工，以開發(fā)出新的蛋制品如蛋粉、蛋液，從而拓寬蛋品的應(yīng)用領(lǐng)域。

蛋清粉具有起泡性、凝膠性和乳化性等加工特性，是食品工業(yè)中一種優(yōu)質(zhì)的加工輔料，功能性蛋清粉因為具有良好的加工特性且運輸貯存方便而被廣泛研究。Erem等[3]利用蛋清蛋白的高起泡性來改善面包質(zhì)構(gòu)。Bonet[4]和Wilderjans[5]等研究了蛋清蛋白的凝膠性在面團和蛋糕中發(fā)揮的作用，并猜測很可能是由于蛋清蛋白與其他蛋白形成混合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)改善了面團和蛋糕的性能。Lee等[6]的研究表明，使用木瓜蛋白酶水解液態(tài)蛋清后制得的蛋清粉起泡性有顯著提升。遲玉杰[7]和趙薇[8]等分別對蛋清蛋白進行糖基化和磷酸化改性處理，干燥得到的蛋清粉凝膠強度和持水性增強。范蓓等[9]發(fā)明了一種高起泡性蛋清粉，將大豆分離蛋白與蛋清液混合后調(diào)節(jié)pH值至8～10，干燥后可得到高起泡性蛋清粉，且操作簡單。但是這些研究普遍都是對蛋清粉的凝膠性、起泡性等性質(zhì)進行改良，對于蛋清粉的溶解性、速溶性研究較少。蛋清粉良好的溶解性是實現(xiàn)其他加工特性的基礎(chǔ)，開發(fā)速溶性蛋清粉不僅可以提高其溶解性和分散性，也可以改善其他功能特性。有學(xué)者使用酶解和磷酸化改性來制備溶解性良好的蛋清粉，同時其起泡性、凝膠性都有所改善[10]。柴萍萍等[11]對比了多種方法制備速溶蛋黃粉，其中以乙二胺四乙酸絡(luò)合和磷脂酶A水解兩種方法效果最好，但是考慮到食品的安全性，最后確定以內(nèi)源蛋白酶和外加蛋白酶水解的方法更適合實際的生產(chǎn)。然而酶解法最大的問題就是酶解后會產(chǎn)生苦味[12]，樣品易吸濕[13]，且滅酶條件要求高。

超聲處理以其高效節(jié)能、綠色環(huán)保、對產(chǎn)品品質(zhì)和營養(yǎng)破壞率低等優(yōu)勢受到越來越多的關(guān)注，在食品工業(yè)中應(yīng)用越來越廣[14]。食品加工中常使用16～100 kHz的超聲波來改變食品的物理化學(xué)性質(zhì)[15-16]，研究發(fā)現(xiàn)超聲功率、時間、物料濃度等因素會對蛋白質(zhì)的溶解度、乳化性、凝膠性、起泡性等產(chǎn)生影響[17-19]。因此，本實驗中使用不同的超聲時間、功率以及蛋清液體積分?jǐn)?shù)來處理蛋清蛋白，并研究各不同處理方法對噴霧干燥制得的蛋清粉速溶性質(zhì)的影響，以探求適宜的超聲條件，為速溶蛋清粉的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮海蘭褐雞蛋 湖北省農(nóng)科院畜牧所；一水檸檬酸（食品級） 英軒實業(yè)有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒（生化試劑） 武漢谷歌生物有限公司；蛋白質(zhì)電泳預(yù)染Marker（生化試劑） 美國Thermo Scientific公司；SDS（化學(xué)純）、冰醋酸、無水乙醇（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍R-250 武漢飛揚生物有限公司；Tris-base、甘氨酸、SDS-PAGE 5×蛋白上樣緩沖液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 中國Biosharp生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HJ-4多頭磁力加熱攪拌器 常州國華電器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上?？茽杻x器設(shè)備有限公司；FE20數(shù)顯pH計、MS104S/01分析天平上海梅特勒-托利多儀器有限公司；YP502N電子天平上海精密儀器科技有限公司；FS-600N超聲波細(xì)胞粉碎儀 上海生析超聲儀器有限公司；Nanodrop 2000c紫外-分光光度計 美國Thermo Scientific公司；20 目標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩 浙江上虞市五四紗篩廠制造；ALPHAI1-4真空冷凍干燥機 德國Christ公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；JSM-6390掃描電子顯微鏡 日本NTC公司；Mastersizer 2000激光粒度分布儀 英國Malvern儀器有限公司；J-810圓二色光譜儀 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清液的制備

挑取新鮮的雞蛋清洗晾干，使用分蛋器將蛋清和蛋黃分開，挑出蛋清中的系帶，使用磁力攪拌器低速攪拌，將蛋清液的濃厚蛋白和稀薄蛋白攪拌均勻，形成黏度均一、無蛋白團塊的蛋清液后在干凈的環(huán)境中自然發(fā)酵24 h。使用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)蛋清液的pH值，邊攪拌邊調(diào)節(jié)pH值至接近7.5，緩慢加入蒸餾水將蛋清液稀釋到實驗所需體積分?jǐn)?shù)，攪拌均勻后將pH值調(diào)節(jié)到7.5左右。

1.3.2 超聲處理

使用超聲波細(xì)胞粉碎儀對經(jīng)過預(yù)處理的蛋清液進行超聲處理。在500 mL的燒杯中倒入300 mL待超聲蛋清液，將超聲探頭深入到液面之下3 cm左右，調(diào)節(jié)超聲時間和功率進行超聲實驗。整個超聲過程中燒杯都置于冰水浴中以保持蛋清液的溫度基本不變，防止超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)使蛋清液局部溫度過高從而使蛋白變性。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

試驗中采用連續(xù)超聲模式，超聲頻率固定為20 kHz。在單因素試驗中，以蛋清粉的分散性、溶解度和穩(wěn)定系數(shù)為評價指標(biāo)，研究不同超聲時間、功率和超聲時蛋清液體積分?jǐn)?shù)對制得蛋清粉的速溶性能的影響。固定超聲功率為120 W、蛋清液體積分?jǐn)?shù)為20%，設(shè)置超聲時間分別為0、5、10、15、20、25、30 min；固定超聲時間15 min、蛋清液體積分?jǐn)?shù)為20%，設(shè)置超聲功率為0、90、120、150、180、210、240 W；在固定超聲時間為15 min、超聲功率為150 W的條件下對體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%的蛋清液進行超聲處理。

1.3.4 超聲條件正交優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗，因素水平設(shè)計如表1所示。正交試驗以分散性、溶解度和穩(wěn)定系數(shù)為考察指標(biāo)，綜合對比確定超聲處理蛋清液的最優(yōu)參數(shù)。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels used for orthogonal array design

1.3.5 不同處理方式蛋清粉的制備

將未經(jīng)超聲處理的蛋清原液和經(jīng)過最優(yōu)超聲條件處理后的蛋清液分別加入蒸餾水稀釋到蛋清液體積分?jǐn)?shù)20%后，用20 目篩網(wǎng)過濾掉溶液中的不溶物質(zhì)，進行噴霧干燥。噴霧干燥條件為進風(fēng)溫度170 ℃，流量1 200 mL/h[20-21]。同時，將未經(jīng)超聲處理的蛋清原液和經(jīng)過最優(yōu)超聲條件處理后的蛋清液分別進行真空冷凍干燥制成蛋清凍干粉，收集噴霧干燥和冷凍干燥制得的不同樣品，標(biāo)注信息并密封保存用于后續(xù)實驗指標(biāo)的測定。

1.3.6 蛋清粉分散性的測定

參考李佳寧[22]的方法并作改進，在100 mL燒杯中加入30 mL蒸餾水后放于恒溫水浴鍋中保溫，溫度設(shè)定為40 ℃。稱取1.00 g蛋清粉樣品均勻緩慢地倒入燒杯中，使用磁力攪拌器以中等轉(zhuǎn)速勻速攪動，同時記錄從攪拌開始到蛋清粉結(jié)塊組織全部潤濕分散所需的時間。實驗重復(fù)3 次，取其平均值作為分散時間來評價蛋清粉的分散性。

1.3.7 蛋清粉溶解度的測定

參考馬爽[23]和GB 5413.29—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中溶解性的測定》的方法并稍作修改。稱取2.00 g蛋清粉，用30 mL 25～30 ℃的蒸餾水分?jǐn)?shù)次將蛋清粉溶解于50 mL離心管中，加塞。將離心管置于30 ℃蒸餾水中保溫5 min，取出后搖動3 min。以9 000 r/min離心10 min，使不溶物沉淀。傾去上清液，再加入25～30 ℃的水30 mL，加塞，上下振蕩，使沉淀懸浮，再次離心10 min，傾去上清液，移入110 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量（最后兩次質(zhì)量差不超過2 mg）。同時參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中的方法測定蛋清粉樣品的水分含量，實驗重復(fù)3 次。樣品溶解度按公式（1）計算。

式中：m為樣品質(zhì)量/g；m1為離心管質(zhì)量/g；m2為離心管和不溶物干燥后質(zhì)量/g；B為樣品水分含量/（g/g）。

1.3.8 蛋清粉穩(wěn)定系數(shù)的測定

參考葉蕾等[24]的方法測定穩(wěn)定系數(shù)，取0.50 g蛋清粉樣品用蒸餾水配制成5 mg/mL溶液，取一定體積的蛋清粉溶液于50 mL離心管中，3 000 r/min離心20 min，取1 mL上清液稀釋10 倍后置于1 cm比色皿中，以蒸餾水作為空白對照，測定280 nm波長處的吸光度A1和離心前的吸光度A2，穩(wěn)定系數(shù)按公式（2）計算，實驗重復(fù)3 次。

1.3.9 蛋清粉的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE參考胡珊[25]的方法，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%分離膠和5%濃縮膠。將不同處理方法制成的蛋清粉用50 mmol/L、pH 7.0的PBS配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋清粉溶液。取80 μL樣液加入200 μL離心管中，加入20 μL 5×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇），混勻后沸水浴加熱3～5 min，冷卻備用，用微量進樣針取15 μL樣液和蛋白Marker分別加入樣品槽后電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。膠板用固定液固定30 min，染色液染色30 min，然后用脫色液多次脫色將背景顏色脫除。

1.3.10 蛋清粉的掃描電子顯微鏡觀察

取一定量的蛋清粉樣品粘于樣品臺上并噴鍍金電導(dǎo)層，在高分辨率掃描電子顯微鏡下放大200 倍觀察4 種粉體的形態(tài)差異，并進一步放大500 倍和2 000 倍觀察噴霧干燥制得的蛋清粉的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.11 蛋清粉的粒徑分析

使用激光納米粒度分析儀測定不同蛋清粉樣品的粒徑和分布狀況，每個樣品重復(fù)測定3 次，記錄平均粒徑。

1.3.12 蛋清粉表面疏水性的測定

使用8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針法測定蛋清粉的表面疏水性。用PBS（10 mmol/L、pH 7.2）配制濃度為8 mmol/L的ANS溶液，同時將樣品稀釋為不同質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）的溶液。取不同質(zhì)量濃度的稀釋液10 mL，使用熒光分光光度計，在390 nm激發(fā)波長和470 nm發(fā)射波長處分別測定樣品的熒光強度FI0和樣品加入20 μL ANS溶液后的熒光強度FI1，F(xiàn)I1和FI0的差值記為FI，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、FI為縱坐標(biāo)作圖，曲線初始階段的斜率記為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。將未超聲的蛋清凍干粉的表面疏水性假定為1.0，其余樣品與其的比值記作表面疏水性相對指數(shù)。

1.3.13 蛋清粉的圓二色光譜測定

取不同方法制備的蛋清粉溶于蒸餾水中配制成0.2 mg/mL溶液，掃描波長范圍190～250 nm，掃描速率100 nm/min，光譜間隔0.1 nm，平行測定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.0軟件作圖，使用SPSS 17.0軟件進行正交試驗的方差分析和多重比較分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時間對蛋清粉分散性、溶解度和穩(wěn)定系數(shù)的影響

圖1 超聲時間對蛋清粉分散時間（A）、溶解度（B）和穩(wěn)定系數(shù)（C）的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment time on dispersion time (A),solubility (B) and stability coefficient (C) of egg white powder

由圖1可知，隨著超聲時間的延長，超聲后制得蛋清粉的分散時間在超聲前5 min沒有明顯變化，之后隨超聲時間的延長明顯降低，超聲15 min時分散時間最短，為（82.67±4.16）s，然后其又繼續(xù)隨超聲時間的延長逐漸延長。而隨著超聲時間的延長，超聲后制得蛋清粉的溶解度緩慢增加，在超聲10 min時最高，為（95.69±0.68）g/100 g，此后到20 min時溶解度基本維持穩(wěn)定，變化不明顯，20 min之后明顯開始下降。隨著超聲時間的延長，蛋清粉穩(wěn)定系數(shù)都優(yōu)于未超聲的蛋清粉，其中超聲15 min時穩(wěn)定系數(shù)最高，達（99.10±0.58）%。這可能是因為一定時間的超聲可以破壞蛋白質(zhì)聚集，使蛋白質(zhì)復(fù)合物解離分散，從而使更多的可溶性蛋白質(zhì)分散到溶液中[26]，但是蛋清蛋白質(zhì)對外力的作用變化十分敏感，所以短時間的超聲即可使聚集的蛋清蛋白質(zhì)分散開，超聲時間過長會造成蛋白質(zhì)的再聚集，使其疏水性增加，分散性和溶解度下降，溶液中的不溶性蛋白質(zhì)含量增加，溶液的穩(wěn)定系數(shù)也就相應(yīng)的降低。Jambrak等[27]用超聲處理大豆分離蛋白和大豆?jié)饪s蛋白的溶液后得到了相似的結(jié)果；孫英杰[28]用超聲處理大豆蛋白的時候也發(fā)現(xiàn)隨著超聲時間的延長，大豆蛋白的溶解度出現(xiàn)了先增加后降低的趨勢。因此，選擇超聲時間10、15、20 min進行正交試驗。

2.2 超聲功率對蛋清粉分散性、溶解度和穩(wěn)定系數(shù)的影響

圖2 超聲功率對蛋清粉分散時間（A）、溶解度（B）和穩(wěn)定系數(shù)（C）的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on dispersion time (A), solubility (B)and stability coefficient (C) of egg white powder

從圖2中可以看出，超聲功率為90 W時蛋清粉的分散時間與未超聲蛋清粉沒有明顯差異。超聲功率升高到150 W時分散時間縮短至（69.33±2.08）s，分散性明顯優(yōu)于其他樣品。在超聲功率120 W和150 W時制得蛋清粉的穩(wěn)定系數(shù)明顯高于其他功率下制備的樣品，分別為（94.20±0.32）%和（93.69±0.42）%，這主要與超聲的空化效應(yīng)破壞不穩(wěn)定的蛋白聚集形成小的可溶性物質(zhì)有關(guān)[29]。隨著超聲功率的升高，蛋清粉的溶解度在120 W時最高，為（92.96±1.11）g/100 g，功率繼續(xù)升高時溶解度在87～91 g/100 g間波動。推測可能是在高功率超聲處理時，蛋白質(zhì)的溶解度雖然增加，但是分散性和穩(wěn)定系數(shù)并沒有改善，這可能也與蛋白質(zhì)的再聚集有關(guān)。蛋白質(zhì)聚集形成大的蛋白質(zhì)分子，再聚集的過程中部分可溶性蛋白質(zhì)與不溶性蛋白質(zhì)結(jié)合，雖然最終溶解度可能略有增加，但是分散時間延長且聚合物不穩(wěn)定，所形成溶液的穩(wěn)定系數(shù)也仍會降低。Jiang Lianzhou等[29]在研究超聲處理黑豆分離蛋白時發(fā)現(xiàn)，隨著超聲功率的增加，蛋白質(zhì)的溶解度會增加，但是進一步增加超聲功率和延長時間，溶解度反而會降低；他們認(rèn)為超聲波可能使蛋白質(zhì)部分解折疊，從而使蛋白質(zhì)與水分子間的相互作用增加，當(dāng)超聲強度增加時，蛋白分子通過非共價相互作用形成聚合物使溶解性降低。綜合考慮分散性、溶解性和穩(wěn)定系數(shù)后選擇在超聲功率120、150、180 W進行正交試驗。

2.3 蛋清液體積分?jǐn)?shù)對蛋清粉分散性、溶解度和穩(wěn)定系數(shù)的影響

如圖3所示，體積分?jǐn)?shù)50%時蛋清粉分散時間為（76.44±0.19）s，分散性明顯優(yōu)于其他體積分?jǐn)?shù)樣品；而蛋清粉的溶解度沒有發(fā)生明顯變化，在蛋清液體積分?jǐn)?shù)70%的時候有所下降；在蛋清液體積分?jǐn)?shù)低于50%時，蛋清粉的穩(wěn)定系數(shù)沒有明顯變化，都高于90%，體積分?jǐn)?shù)高于50%時，蛋清粉穩(wěn)定系數(shù)開始有明顯的降低趨勢。隨著蛋清液體積分?jǐn)?shù)的增加，溶液中的蛋白質(zhì)分子含量增加，超聲波對蛋白質(zhì)分子的作用增強，空化作用使更多的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子結(jié)構(gòu)變得疏松展開，蛋白質(zhì)分子的親水基團暴露。同時，卵黏蛋白及溶菌酶等蛋白質(zhì)聚合形成的難溶聚合體被分散，更多的可溶性蛋白質(zhì)被釋放到水溶液中，蛋清粉所需要的分散時間縮短。蛋清是一種膠體物質(zhì)，自身黏度很大，蛋清液體積分?jǐn)?shù)超過50%時，超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)會使局部溫度快速升高，不能及時通過冰水浴散熱降溫。而蛋清蛋白質(zhì)的變性溫度為65 ℃[30]，溫度過高會使蛋清蛋白質(zhì)發(fā)生變性凝膠化，尤其是一些可溶性蛋白質(zhì)如卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白等遇熱易變性[31]，在噴霧干燥前被過濾掉，降低了蛋白粉中可溶性蛋白質(zhì)的比例。湯虎[32]在研究超聲改性小麥面筋蛋白時也發(fā)現(xiàn)，隨著底物體積分?jǐn)?shù)的增加，小麥面筋蛋白的溶解度明顯提高，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)超過10%時，在相同時間內(nèi)超聲的空化效應(yīng)減弱，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變變小，可溶性蛋白質(zhì)含量減少，溶解度下降。一定范圍內(nèi)體積分?jǐn)?shù)的變化所產(chǎn)生的超聲強度的變化并不明顯，所以蛋清粉速溶特性的提高并不明顯，但是考慮到實際生產(chǎn)加工過程中的能耗成本等因素，選擇相對較高的蛋清液體積分?jǐn)?shù)可以有效地節(jié)省成本、提高生產(chǎn)效率，故選擇超聲時蛋清液的體積分?jǐn)?shù)為30%、40%和50%進行正交試驗。

圖3 蛋清液體積分?jǐn)?shù)對蛋清粉分散時間（A）、溶解度（B）和穩(wěn)定系數(shù)（C）的影響Fig.3 Effect of egg white concentration on dispersion time (A), solubility (B)and stability coefficient (C) of egg white powder

2.4 正交試驗結(jié)果與分析

從表2可以看出，影響蛋清粉分散性的因素主次順序為：C＞A＞B，分散時間最短的最優(yōu)水平是A3B1C3，即超聲時間20 min、超聲功率120 W、蛋清液體積分?jǐn)?shù)50%；影響蛋清粉溶解度的因素主次順序為C＞A＞B，溶解度最優(yōu)的水平組合為A1B3C3，即超聲時間10 min、超聲功率180 W、蛋清液體積分?jǐn)?shù)50%；影響蛋清粉穩(wěn)定系數(shù)的因素主次順序為：A＞C＞B，穩(wěn)定系數(shù)最高的水平組合為A1B3C1，即超聲時間10 min、超聲功率180 W、蛋清液體積分?jǐn)?shù)30%。從表3可以看出，超聲時間和超聲時蛋清液體積分?jǐn)?shù)對蛋清粉的速溶性（分散時間、溶解度、穩(wěn)定系數(shù)）影響顯著（P＜0.05），超聲功率的影響不顯著。結(jié)合表4可以得到蛋清粉分散時間、溶解度和穩(wěn)定系數(shù)的正交試驗最優(yōu)的超聲條件組合是A1B1C3。綜合考慮實驗結(jié)果以及實際生產(chǎn)過程中的能耗成本等因素，最終確定速溶性蛋清粉的超聲處理條件為A1B1C3，即超聲時間10 min、超聲功率120 W、蛋清液體積分?jǐn)?shù)為50%。

表2 正交試驗結(jié)果及極差分析Table2 Orthogonal array design with range analysis of experimental results

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table3 Analysis of variance for the experimental results from orthogonal array design

表4 正交試驗多重比較結(jié)果Table4 Multiple comparison of the experimental results from orthogonal array design

在該超聲條件下對蛋清液進行驗證實驗，最終制備蛋清粉的平均分散時間為56.67 s，平均溶解度為93.56 g/100 g，>平均穩(wěn)定系數(shù)為97.29%，優(yōu)于正交試驗中的結(jié)果。

2.5 SDS-PAGE分析結(jié)果

圖4 不同方法制備的蛋清粉的SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE of egg white powder prepared by different methods

從圖4中可以看出，蛋清經(jīng)過超聲處理后，噴霧干燥制得的蛋清粉的蛋白質(zhì)組分與純蛋清粉相比差異不明顯，這表明超聲沒有改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，Karki[33]和Zhang Qiuting[34]等在研究超聲處理大豆分離蛋白和花生分離蛋白的SDS-PAGE時也得到了相似的結(jié)果。但是對比樣品A、D可以看到，分子質(zhì)量大于100 kDa時樣品A中有3 條條帶，而樣品D中只存在1 條條帶，這說明超聲使一些分子質(zhì)量大于100 kDa的蛋白質(zhì)發(fā)生解離，這主要是因為超聲空化作用破壞了蛋白質(zhì)的聚集（主要是卵黏蛋白聚集物）。樣品B、C都是經(jīng)過噴霧干燥制得的蛋清粉，由于在噴霧干燥前會進行加水稀釋并過濾，一些卵黏蛋白及其聚集物在噴霧干燥前就已被除去，通過對比可以看到超聲處理之后的蛋清粉在約35 kDa處的蛋白含量增多，這也進一步證實超聲主要破壞了蛋白質(zhì)的聚集。Jambrak等[35]研究乳清蛋白也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，20 kHz超聲會使局部分子間的疏水相互作用被破壞，乳清蛋白顆粒尺寸和分子質(zhì)量減小。

2.6 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

圖5 不同方法制備的蛋清粉掃描電子顯微鏡圖（×200）Fig.5 Scanning electron microscopy images of egg white powder prepared by different methods (× 200)

從蛋清粉樣品的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果可以看出不同方法制備的蛋清粉之間的形態(tài)差距較大。凍干粉呈片狀結(jié)構(gòu)，形態(tài)和大小分布不均（圖5A、D），超聲前后的形態(tài)變化主要與外力擠壓破碎有關(guān)。而噴霧干燥后的蛋清粉顆粒形狀規(guī)則、粒徑較?。▓D5B、C），這主要與噴霧干燥過程造粒有關(guān)。

圖6 超聲前后噴霧干燥制備的蛋清粉的掃描電子顯微鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy images of egg white powder prepared by spray drying with and without ultrasonic pretreatment

從圖6可以看出，經(jīng)過噴霧干燥后的蛋清粉成帶孔顆粒狀，超聲之后的蛋清粉顆粒小于未超聲樣品，且分散均勻，顆粒間的聚集程度較低（圖6C），這些結(jié)構(gòu)都有助于蛋清粉在水中的快速分散溶解。通常認(rèn)為分散系中的顆粒越小對應(yīng)的溶解度越高[36]，郭武漢等[37]研究超微粉碎處理小麥面筋蛋白時也發(fā)現(xiàn)處理后隨著粉體粒徑的減小，溶解度整體明顯增加。

2.7 蛋清粉的粒徑分析

從圖7可以看出，不同方法制備的蛋清粉溶液的粒徑分布差別明顯。與原蛋清凍干粉相比較，超聲處理和噴霧干燥都會使蛋白質(zhì)的粒徑減小，對比樣品A、D可以看到，超聲的主要作用為減少大粒徑的蛋白質(zhì)分子，說明超聲會使大分子蛋白質(zhì)發(fā)生裂解，與SDS-PAGE分析結(jié)果（圖6）對應(yīng)。樣品B、C是經(jīng)過噴霧干燥制得的蛋清粉，由于噴霧干燥過程中伴隨著造粒，所以粒徑均小于1 000 nm，樣品B、C中粒徑大于和小于100 nm的部分約占36%和64%，但超聲處理后制得的樣品更傾向于向較小的粒徑范圍分布，粒徑的減小有利于蛋清粉在水中的分散。

圖7 不同方法制備的蛋清粉溶液的粒徑分布Fig.7 Particle size distribution of egg white powder prepared by different methods

2.8 蛋清粉的表面疏水性分析

圖8 不同方法制備的蛋清粉的表面疏水性相對指數(shù)Fig.8 Relative hydrophobicity indices of egg white powder prepared by different methods

經(jīng)過超聲和噴霧干燥處理后制得的蛋清粉與蛋清凍干粉相比表面疏水性發(fā)生了明顯變化，這主要是因為超聲和高溫會使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。比較圖9中樣品A、D和B、C可以看出，超聲可以增加蛋白質(zhì)的表面疏水性，這主要與超聲的空化作用有關(guān)，超聲會破壞蛋白質(zhì)大分子聚集物，使其疏水基團暴露，表面疏水性增加，溶解度增大[26]。與樣品A、D相比可以看出，噴霧干燥的高溫會使樣品B、D的蛋白質(zhì)變性，一部分疏水基團被包裹起來，疏水性有所降低，但是結(jié)合圖5中蛋清粉形態(tài)差異分析，噴霧干燥帶來的速溶性的提高也與蛋清粉顆粒疏松多孔的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.9 蛋清粉的圓二色光譜分析

圖9顯示超聲和噴霧干燥都會使蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化。α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)中含有較多的氫鍵，超聲的空化作用和高溫都會使蛋白質(zhì)氫鍵的取向發(fā)生不同程度的重排。由表5對比樣品A、D可以看出，超聲使蛋白質(zhì)的α-螺旋比例減少，β-折疊比例增多，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)趨于無序狀態(tài)，對比樣品B、C也可以看到超聲使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋比例減少，β結(jié)構(gòu)（包括β-折疊和β-轉(zhuǎn)角）比例稍有增加。這表明蛋白質(zhì)在超聲作用下結(jié)構(gòu)會趨于展開，發(fā)生分子伸展[17]，同時導(dǎo)致其表面疏水性增加[38]，這也與2.8節(jié)表面疏水性的結(jié)果一致，這些因素綜合作用使得蛋白質(zhì)的溶解度增加。

圖9 不同方法制備的蛋清粉的圓二色光譜圖Fig.9 Circular dichroism spectra of egg white powder prepared by different methods

表5 不同方法制備的蛋清粉的二級結(jié)構(gòu)組成Table5 Protein secondary structure contents of egg white powder prepared by different methods

3 結(jié) 論

本研究中采用超聲對蛋清進行預(yù)處理后噴霧干燥，以期得到速溶性能良好的蛋清粉。影響超聲作用效果的因素主要有超聲時間、功率和樣品體積分?jǐn)?shù)，通過正交試驗優(yōu)化得到了超聲處理的最優(yōu)水平組合為超聲時間10 min、超聲功率120 W、蛋清液體積分?jǐn)?shù)50%。在該超聲條件下制備的蛋清粉的平均分散時間為56.67 s，平均溶解度為93.56 g/100 g，平均穩(wěn)定系數(shù)為97.29%，比未經(jīng)超聲處理的蛋清液制備的蛋清粉的平均分散時間縮短了49.83 s，平均溶解度提高了3.34 g/100 g，平均穩(wěn)定系數(shù)提高了4.85%。SDS-PAGE和粒徑分析顯示超聲可以分散蛋清中的大分子蛋白聚集物，掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示超聲后噴霧干燥制備的蛋清粉顆粒較小、分散均勻，同時超聲可以增加蛋清粉蛋白質(zhì)的表面疏水性和無序結(jié)構(gòu)含量，有助于蛋清粉在水中的分散溶解。本研究表明超聲改性蛋清可以提高蛋清粉的速溶性能，且實驗操作環(huán)保安全，為蛋清粉的開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)。