劉曉紅,宋 潔,欒宏偉,劉興寶,李 娟,朱雙杰,張 昕,賈成發(fā),王淑君,王 鵬
(1.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院,遼寧 丹東 118003;2.丹東中科北和科技有限公司,遼寧 丹東 118003;3.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽 滁州 239012)
抗氧化劑在預(yù)防活性氧(reactive oxygen species,ROS) 引起的疾病中發(fā)揮著重要作用[1-2]。研究表明,ROS可引發(fā)機(jī)體退化或病理性事件,如癌癥、哮喘和衰老的發(fā)生[3-5]。ROS過量是由于體內(nèi)自由基產(chǎn)生和抗氧化防御體系之間的不平衡造成的,抗氧化劑在改善免疫功能、減少氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。雖然生物體內(nèi)存在多種內(nèi)源抗氧化劑,主要有酶和非酶的形式,但仍然需要不斷地從飲食或補(bǔ)充劑中提取一定數(shù)量的外源抗氧化劑,以維持活性氧代謝的平衡,特別是在活性氧過度產(chǎn)生的情況下。研究表明,天然食材中獲得的抗氧化劑可以降低機(jī)體退化或病理性事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
蛹蟲草[Cordyceps militaris(L.ex Fr.)Link]為子囊菌門 (Ascomycota) 肉座目 (Hypocreales) 麥角菌科 (Clavicipitaceae) 蟲草屬 (Cordyceps) 的模式種[6]。近年來,由于蛹蟲草具有多種藥用價(jià)值,受到研究者越來越多的關(guān)注[7]。在中國(guó)和東南亞市場(chǎng)蛹蟲草已作為藥物原料和保健食品銷售[8-9]。蛹蟲草的藥理功效包括免疫應(yīng)答消炎、抗菌素、抗心律失常等[10-11]?,F(xiàn)代藥物化學(xué)研究表明,蛹蟲草含有腺苷、蟲草素、蟲草酸、蛋白質(zhì)、多糖、超氧化物歧化酶等活性成分[12-15],這些活性成分具有較強(qiáng)的抗氧化活性[16-19]。然而,以上研究均針對(duì)干蛹蟲草,關(guān)于新鮮蛹蟲草抗氧化性的研究甚少。
研究表明,熱處理可以改變新鮮藥材的化學(xué)組成、含量和活性物的結(jié)構(gòu)[20-21],導(dǎo)致鮮中藥材和干中藥材從化學(xué)成分到藥效都有很大的不同[22-23]。大量研究表明,鮮藥材具有許多獨(dú)特的臨床療效,在臨床疾病、急危重癥和創(chuàng)傷治療方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[24-25]。迄今,鮮見有關(guān)鮮蛹蟲草的研究,也未見關(guān)于鮮蛹蟲草和干蛹蟲草抗氧化活性差異的報(bào)道。因此,本研究擬對(duì)鮮蛹蟲草和干蛹蟲草的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià),為蛹蟲草資源的精深加工提供參考。
樣品:鮮蛹蟲草(No.JS-003) 由遼東生物產(chǎn)業(yè)研究所提供;干蛹蟲草:鮮蛹蟲草放置于50℃烘干箱內(nèi)烘干48 h,然后稱重,7.5 g鮮品蛹蟲草可以獲得1.0 g干品蛹蟲草。
樣品處理:鮮蛹蟲草37.5 g磨碎加入37 mL蒸餾水,干蛹蟲草5.0 g加入50 mL蒸餾水混合,分別用高速勻漿器4 000 r·min-1勻漿10 min,勻漿液定容至100 mL,30℃超聲提取30 min,4層紗布過濾,濾液經(jīng)冷凍干燥,獲得鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品,備用。
1.2.1 DPPH自由基清除活力測(cè)定
利用Ozen.T等方法[26],測(cè)定DPPH自由基清除活力。鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品分別與DPPH甲醇溶液混合,室溫、放置于暗室30 min,用分光光度計(jì)于517 nm處測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度值。
1.2.2 銅離子還原能力的測(cè)定
采用Apak.R等方法[27],鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品分別與硫酸銅、新亞銅試劑和蒸餾水混合,室溫放置30 min,用分光光度計(jì)于450 nm處測(cè)定混合物的吸光度值。
1.2.3 羥基自由基清除活力測(cè)定
根據(jù)Sroka.Z和Cisowski.W方法[28],略加修改,0.02 mol·L-1硫酸亞鐵 100 μL,0.15%雙氧水 45 μL,8 mmol·L-1水楊酸1 mL和蒸餾水4 mL按順序依次混合,將1 mL鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品分別添加到上述混合液中,37℃放置30 min,用分光光度計(jì)于593 nm處測(cè)定有色產(chǎn)物的吸光度值。
1.2.4 總酚提取與含量測(cè)定
總酚提取:利用Brenes.M和Savarese.M等的方法[29-30],略加修改,鮮蛹蟲草樣品與甲醇/水(80∶20) 的溶液混合,室溫放置30 min,用Whatman過濾器將混合液過濾,除去不溶性顆粒,重復(fù)提取3次,收集合并濾液,40℃下真空蒸發(fā),除去濾液中的甲醇,加入正已烷洗滌濾液3次,去除油脂類物質(zhì),再加入乙酸乙酯萃取出酚類物質(zhì),40℃下真空蒸發(fā),干燥后的殘余物溶解在2 mL甲醇中,于4℃貯藏備用。
總酚測(cè)定:采用Folin-Ciocalteu法,略加改進(jìn),測(cè)定樣品的總酚含量。分別取鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品0.1 mL與2.5 mL蒸餾水混合,加入0.25 mL Folin-Ciocalteu試劑,再加入2%Na2CO3溶液2.5 mL,暗環(huán)境下,室溫放置120 min。用分光光度計(jì)于765 nm處測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度值。
1.2.5 總黃酮提取和含量測(cè)定
總黃酮提?。豪肧un L.J.等的方法[31],略加修改。鮮蛹蟲草樣品浸泡在70%乙醇溶液中2.5 h,其中液料比 (w·v-)1為1∶10,55℃超聲提取45 min,提取樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。收集濾液,重復(fù)提取2次。石油醚和乙酸乙酯脫脂,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),真空濃縮干燥,獲得樣品粗提取物。
總黃酮含量測(cè)定:采用分光光度法測(cè)定黃酮類物質(zhì)的含量。鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品各1 mL(4 mg·mL-1),分別加入100 μL濃度為1%的2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯溶液混合,室溫放置20 min。用分光光度計(jì)于404 nm處測(cè)定反應(yīng)樣品的吸光度值。
1.2.6 多糖提取和含量測(cè)定
鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品各25 g,250 mL乙醚索氏提取脫脂,加入250 mL80%乙醇混合24 h。過濾,收集濾液,用500 mL蒸餾水超聲重提殘留物2 h。然后合并濾液,蒸發(fā)濃縮至體積為100 mL,濃縮后的濾液與100 mL氯仿/異戊醇(4∶1) 混合進(jìn)行脫蛋白處理。再過濾,濾液與4倍體積無水乙醇混合24 h,沉淀出的物質(zhì)即為多糖化合物。離心收集沉淀,丙酮洗滌。最終鮮蛹蟲草樣品得到多糖1.44 g,干蛹蟲草樣品得到多糖1.06 g。
1.2.7 蟲草素和腺苷含量的測(cè)定
采用高效液相色譜法[32],測(cè)定鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品中蟲草素和腺苷含量。C18柱(Pinnaclell 5 μm,250 mm×4.6 mm),流動(dòng)相中磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0):甲醇為 85∶15,流速 1 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm,加樣量20 μL,用Waters Empower軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
1.2.8 超氧化物歧化酶純化和活性測(cè)定
超氧化物歧化酶純化:參照Wang Z.S.等的方法[33],分別取50 g鮮蛹蟲草和干蛹蟲草凍干粉,加入 250 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液 (pH8.8)中,其中含有1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟,均質(zhì)離心(15 000 r·min-1)15 min。均質(zhì)粗提液加硫酸銨飽和溶液中攪拌1.5 h,15 000 r·min-1離心15 min。取上清液,加到90%硫酸銨溶液中攪拌、離心,上清液溶入20 mmol·L-1Tris-HCL緩沖液 (pH8.8) 中,再用 20 mmol·L-1Tris-HCL緩沖液 (pH8.8) 透析 2次,過夜。透析所得蛋白在DEAE-FF陰離子交換層析柱(3 cm×12 cm) 上進(jìn)行純化,平衡液為 20 mmol·L-1Tris-HCL緩沖液(pH8.8),采用冷凍干燥法濃縮具有高超氧化物歧化酶活性的層析液。
超氧化物歧化酶活性測(cè)定:采用對(duì)鄰苯三酚氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶活性[34]。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,采用Braford法測(cè)定蛋白質(zhì)[35]。
1.2.9 總抗氧化活性測(cè)定
采用Trolox等效抗氧化活性(trolox equivalent and oxidant capacity,TEAC) 方法[36],測(cè)定樣品總抗氧化活性,2,2’-聯(lián)氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(100 μmol·L-1),雙氧水(50 μmol·L-1)和過氧化物酶(4.4 U·mL-1)混合產(chǎn)生ABTS·+,1 mL ABTS·+分別加入到鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品和奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox) 標(biāo)準(zhǔn)品中,室溫放置10 min,分光光度計(jì)于734 nm處測(cè)定吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,估算TEAC值。
以生育酚作為對(duì)照,研究鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對(duì)DPPH自由基清除能力的影響,結(jié)果見圖1。
圖1 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris on DPPH radical
由圖1可知,鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品濃度在0~4.0 mg·mL-1時(shí),隨著濃度的升高,對(duì)DPPH自由基清除能力不斷增強(qiáng),當(dāng)樣品濃度為4.0 mg·mL-1時(shí),鮮蛹蟲草樣品DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)到86.63%,干蛹蟲草樣品達(dá)到61.36%。顯然鮮蛹蟲草樣品對(duì)DPPH自由基清除能力明顯強(qiáng)于干蛹蟲草樣品。樣品濃度在 4.0 mg·mL-1~8.0 mg·mL-1時(shí),鮮蛹蟲草樣品清除能力超過85%,高于相同濃度下生育酚對(duì)照樣品的清除能力。
以生育酚作為對(duì)照,研究鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對(duì)銅離子還原的抑制作用,結(jié)果見圖2。
圖2 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對(duì)銅離子還原的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of fresh Cordyceps militaris and dryCordyceps militaris on copper ion reduction
由圖2可以看出,鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品濃度在0~4.0 mg·mL-1時(shí),對(duì)銅離子還原的抑制作用具有濃度依賴性。在 1.0 mg·mL-1~8.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),鮮蛹蟲草對(duì)銅離子還原的抑制作用明顯強(qiáng)于干蛹蟲草。濃度在 0.01 mg·mL-1~1.0 mg·mL-1時(shí),鮮蛹蟲草樣品對(duì)銅離子還原的抑制作用弱于對(duì)照生育酚。鮮蛹蟲草濃度處于 2.0 mg·mL-1~8.0 mg·mL-1高濃度時(shí),對(duì)銅離子還原的抑制作用強(qiáng)于對(duì)照生育酚。
以生育酚作為對(duì)照,研究鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對(duì)羥基自由基的清除能力,結(jié)果見圖3。
圖3 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.3 Scavenging activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris on hydroxyl radical.
由圖3可知,鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對(duì)羥基自由基均具有較強(qiáng)的清除能力,樣品濃度在0~8.0 mg·mL-1范圍內(nèi),兩者對(duì)羥基自由基清除能力具有濃度依賴性,但鮮蛹蟲草樣品對(duì)羥基自由基清除能力顯著高于干蛹蟲草樣品(P<0.05)。當(dāng)樣品濃度為2 mg·mL-1時(shí),只有鮮蛹蟲草清除能力高于對(duì)照生育酚,在 4.0 mg·mL-1~8.0 mg·mL-1時(shí),鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品清除能力均明顯強(qiáng)于對(duì)照生育酚。綜上所述,鮮蛹蟲草清除能力強(qiáng)于干蛹蟲草。
鮮蛹蟲草和干蛹蟲草主要活性成分含量見表1。
由表1可知,鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品在多糖、總酚、總黃酮含量方面均存在顯著性差異(P<0.01),這三種活性成分在鮮蛹蟲草樣品中的含量均高于干蛹蟲草樣品,并且鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品中活性成分含量排序?yàn)椋傸S酮含量>總酚含量>多糖含量,腺苷和蟲草素含量無明顯差異。
表1 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草主要活性成分含量及其抗氧化活性比較Tab.1 Compare of the main active components content and antioxidant activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris
由表1還可以看出,干蛹蟲草樣品抗氧化活性顯著低于鮮蛹蟲草樣品(P<0.01)。超氧化物歧化酶純化過程有3個(gè)階段,獲得的3種提取液分別為粗提液、硫酸銨沉淀物和陰離子交換層析液,檢測(cè)3種提取液中總蛋白含量和超氧化物歧化酶的活性結(jié)果,見表2。
表2 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草中超氧化物歧化酶含量及活性比較Tab.2 Compare of the superoxide dismutase content and activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris
由表2可以看出,鮮蛹蟲草中超氧化物歧化酶的含量與總活力均高于干蛹蟲草,且超氧化物歧化酶純化提取物中,鮮蛹蟲草所得粗提液和硫酸銨沉淀物比活度是干蛹蟲草的1.3倍(P<0.01),鮮蛹蟲草中陰離子交換層析液比活度是干蛹蟲草的1.8倍。
鮮蛹蟲草中超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃酮的抗氧化活性,見圖4。
圖4 鮮蛹蟲草中超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃酮的抗氧化活性Fig.4 Total antioxidant activity of the superoxide dismutase,polysaccharide,polyphenol and total flavonoids of fresh Cordyceps militaris
由圖4可知,樣品濃度在0~8.0 mg·mL-1之間,蛹蟲草的超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃酮的抗氧化活性隨著濃度的升高而增大,這說明鮮蛹蟲草中的超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃銅具有較強(qiáng)的抗氧化活性。鮮蛹蟲草中腺苷和蟲草素總抗氧化性活性見表3。
由表3可以看出,根據(jù)不同濃度組合,分別測(cè)定鮮蛹蟲草中多糖和腺苷組合、多糖和蟲草素組合后的TEAC值,所得結(jié)果與鮮蛹蟲草多糖抗氧化活性TEAC值相比無顯著差異。鮮蛹蟲草樣品中多糖和腺苷組合、多糖和蟲草素組合的清除能力與鮮蛹蟲草樣品多糖幾乎一樣,表明腺苷和蟲草素這兩種生物活性成分不能促進(jìn)蛹蟲草的抗氧化活性。
表3 鮮蛹蟲草中腺苷和蟲草素總抗氧化性活性Tab.3 Total antioxidant activity of adenosine,cordycepin of fresh Cordyceps militaris
生物系統(tǒng)中抗氧化系統(tǒng)很復(fù)雜[37],采用不同方法分析抗氧化活性可得不同的反應(yīng)特性和機(jī)理,在實(shí)際研究中,至少使用2種互補(bǔ)的方法來評(píng)價(jià)體外抗氧化能力[38]。DPPH自由基是穩(wěn)定的自由基,DPPH自由基清除能力檢測(cè)法是1種評(píng)價(jià)抗氧化活性的快速方法[39]。銅離子對(duì)機(jī)體內(nèi)的硫醇類抗氧化劑如谷胱甘肽具有反應(yīng)性[40],由于體內(nèi)廣泛存在羥基自由基[38,41],故羥基自由基清除能力的檢測(cè)被廣泛用于抗氧化活性的測(cè)定。此外,在測(cè)定特定物質(zhì)的抗氧化能力時(shí),Trolox等效抗氧化活性檢測(cè)也被常用于評(píng)價(jià)活性物質(zhì)的抗氧化能力。因此我們選擇了這四種方法來評(píng)價(jià)鮮蛹蟲草和干蛹蟲草的抗氧化能力。結(jié)果表明,4種方法均能較準(zhǔn)確地反映鮮蛹蟲草和干蛹蟲草抗氧化活性。
目前,在中國(guó)、韓國(guó)和東南亞地區(qū),蛹蟲草被作為醫(yī)藥材料和保健食品出售[9]。研究表明,蛹蟲草具有顯著的治療效果,如免疫刺激[17]。已有研究表明,蛹蟲草提取物能提高小鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶的酶活性,降低H22型小鼠肝臟中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的含量。近年來,大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,蛹蟲草子實(shí)體水提取物對(duì)寄主具有抗氧化活性[42]。蛹蟲草子實(shí)體水提液顯示了對(duì)DPPH、羥基自由基明顯的清除能力和對(duì)亞鐵離子的螯合作用,對(duì)亞油酸脂質(zhì)過氧化和還原能力也有抑制作用[16]。本研究顯示,干蛹蟲草具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力、銅離子還原能力和羥基自由基清除能力,且均呈劑量依賴性,但其抗氧化活性顯著低于鮮蛹蟲草,且鮮蛹蟲草濃度在 4.0 mg·mL-1~8.0 mg·mL-1時(shí),抗氧化活性明顯高于生育酚。所以鮮蛹蟲草是1種天然的抗氧化劑資源。
抗氧化能力與活性成分的含量有關(guān)。蛹蟲草的主要成分為超氧化物歧化酶、蟲草素、腺苷和蟲草多糖[13]。這些主要成分中,除了蛹蟲草多糖外,其他活性成分的抗氧化活性僅有少量報(bào)道[18]。另外,已有報(bào)道表明總酚和總黃酮具有良好的抗氧化能力。為進(jìn)一步探討活性成分在鮮蛹蟲草和干蛹蟲草抗氧化活性中的作用,本研究測(cè)定了鮮蛹蟲草和干蛹蟲草中主要活性成分,包括超氧化物歧化酶、多糖、腺苷、蟲草素、總酚和總黃酮含量。本研究顯示,除活性成分腺苷和蟲草素外,鮮蛹蟲草中其他活性成分均明顯高于干蛹蟲草,導(dǎo)致這種結(jié)果可能有2個(gè)因素,一是熱處理使部分活性成分裂解,另一個(gè)是由于酶的作用使熱敏成分分解[20]。
此外,為闡明蛹蟲草主要活性成分對(duì)抗氧化活性的影響,本試驗(yàn)從蛹蟲草中分別提取出多糖、超氧化物歧化酶、總酚和總黃酮,并采用了Trolox等效抗氧化活性檢測(cè)法評(píng)價(jià)了其抗氧化活性。Trolox等效抗氧化活性綜合分析方法優(yōu)于多個(gè)測(cè)定分析的方法,能有效評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。由于蟲草多糖已被證明具有顯著的抗氧化活性,本研究以蛹蟲草多糖為對(duì)照。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示,腺苷和蟲草素不能促進(jìn)蛹蟲草抗氧化活性。此結(jié)果與Yu和Yang[17]結(jié)論相一致。關(guān)于鮮蛹蟲草和干蛹蟲草超氧化物歧化酶抗氧化活性鮮有報(bào)道,本研究結(jié)果顯示,鮮蛹蟲草超氧化物歧化酶抗氧化活性顯著高于干蛹蟲草。此外,鮮蛹蟲草提取物中總酚和總黃酮含量分別為(87.56±0.04) mg·g-1和 (182.24±0.07) mg·g-1,干蛹蟲草為 (58.34±0.03) mg·g-1和(125.86±0.03)mg·g-1,均表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性,這與已報(bào)道結(jié)論不一致,先前有研究顯示蛹蟲草中總酚和總黃酮的含量分別為 0.598 μg·mL-1和 60.2 μg·mL-1,這種相對(duì)含量較低的活性物質(zhì)對(duì)蛹蟲草的抗氧化活性貢獻(xiàn)率是很低的[17]。
綜上所述,本研究表明,鮮蛹蟲草和干蛹蟲草均具有抗氧化活性,而且鮮蛹蟲草的抗氧化活性優(yōu)于干蛹蟲草。此外,鮮蛹蟲草中多糖、超氧化物歧化酶、總酚和總黃酮等活性成分的含量均高于其在干蛹蟲草中的含量。鮮蛹蟲草所含的多糖、超氧化物歧化酶、總酚和總黃酮等成分具有顯著的抗氧化活性。這些結(jié)果表明,鮮蛹蟲草是良好的抗氧化劑資源,有待進(jìn)一步開發(fā)利用。