羊肚菌菌種的分離與純化和形態(tài)鑒定

康曉彤

（沈陽市同澤高級中學，遼寧 沈陽 110013）

羊肚菌（Morchella sp.），俗稱羊肚菜、羊肚蘑、木耳蘑菇、狼肚菜等[1]。羊肚菌口感好，風味獨特，而且營養(yǎng)價值極高[2-3]。據(jù)分析測定，每100克干品羊肚菌中含水分12.86 g、脂肪3.82 g、蛋白質(zhì)22.06 g，其中蛋白質(zhì)含量是木耳（Auricularia auricula） 的2倍，是香菇（Lentinus edodes） 的1.5倍，且極易被人體吸收[4]?，F(xiàn)代營養(yǎng)學和醫(yī)學研究表明，羊肚菌是一種高級營養(yǎng)滋補品，具有補腎、壯陽、補腦、提神的功能[5-6]。對頭暈失眠、腸胃炎癥、脾胃虛弱、消化不良、飲食不振等有良好的療效[7]。同時還對腫瘤有抑制作用，對大腸桿菌和枯草桿菌也有抑制作用[8]。長期食用可以防癌抗癌、抑制腫瘤、預防感冒、增加人體免疫力[9-10]。以羊肚菌為原料的保健品已得到美國Food and Drug Administration的正式許可。美味羊肚菌的菌絲體適合液體培養(yǎng)法培養(yǎng)菌絲[11]，菌絲體中含有子實體固有的營養(yǎng)成分和生物活性成分，能較好地保持子實體的獨特風味，且羊肚菌菌絲體的生產(chǎn)較子實體的生產(chǎn)更容易[12]。因此，羊肚菌純菌種的分離具有十分重要的意義，是野生馴化、人工栽培的前提和基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采自沈陽農(nóng)業(yè)大學后山的野生羊肚菌子實體。

本次試驗所采集的子實體為2017年5月上旬采集。采后除去表面異物及菌柄基部泥土等，編號后用無菌紙包裹裝入盒內(nèi)，及時拿回實驗室以供分離用。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織分離法

將超凈工作臺清理干凈，把酒精燈、火柴、無菌水、刀片、鐵絲、濾紙、培養(yǎng)基、鑷子、細繩、報紙、一次性手套等放到工作臺上。接通電源，打開紫外燈開關照射殺菌約20 min。打開電源，將子實體放入超凈工作臺，開無菌風使工作臺預熱工作10 min，帶好手套，用鑷子夾取75%的酒精棉將超凈工作臺表面和手擦拭滅菌[13]。將新采集的羊肚菌子實體放在超凈臺上對菌蓋部位進行分離，取菌蓋內(nèi)部組織，切成大小均勻的方塊。具體操作方法見表1。

表1 羊肚菌菌蓋內(nèi)部組織的分離方法

1.2.2 孢子分離法

用滅過菌的刀片沿縱向?qū)⒆訉嶓w切開。然后先用75%的乙醇棉球?qū)⒆訉嶓w的表面及凹陷處擦1遍，再用無菌水沖洗，沖洗后用無菌濾紙吸水，然后用無菌棉球吸干水分。如此重復3次后，將子實體的菌蓋朝下，無菌操作后懸掛于三角瓶棉塞下端的鐵絲彎鉤上。用高壓聚丙稀透明塑料膜包好，做標簽，注明接種情況及接種日期[14-15]。

1.3 培養(yǎng)

接種后的三角瓶和試管均置于室內(nèi)（18℃～20℃）避光培養(yǎng)[16-17]。定期觀察菌絲生長狀況，記錄菌絲萌發(fā)時間、長勢、菌落大小、污染情況和成活率，并做詳細記錄。

1.4 羊肚菌菌種的再純化

經(jīng)培養(yǎng)觀察，選擇長勢良好、無污染的菌種進行進一步的純化試驗，挑取少許菌落，進行斜面劃線培養(yǎng)。

1.5 羊肚菌菌種的液體培養(yǎng)觀察及顯微觀察

在液體培養(yǎng)羊肚菌時，對其進行宏觀觀察，觀察菌絲球的狀態(tài)、顏色和菌液的清澈度。另外，挑取少量菌絲，置于載玻片上，制成菌絲玻片標本，利用顯微鏡觀察菌絲狀態(tài)并照相[18]。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌組織分離的結果

羊肚菌子實體組織分離結果如圖1所示。

圖1 羊肚菌組織塊接種培養(yǎng)情況

由圖1可以看出，羊肚菌子實體組織分離后總體長勢一般，部分試管長勢良好。這可能與組織塊菌絲的活力和滅菌效果有關。滅菌時間過長可能會抑制菌絲的生長。

2.2 羊肚菌孢子分離的結果

羊肚菌子實體孢子分離結果如圖2所示。

圖2 孢子分離母種接種情況

由圖2可以看出，由孢子分離得到的菌種菌絲效果很好，菌絲呈乳白色，長勢致密，無污染的現(xiàn)象。這可能是因為子實體彈射的孢子活力強。

2.3 羊肚菌的純化效果

羊肚菌的純化結果見圖3和圖4。

圖3 組織分離母種的純化結果

圖4 孢子分離母種的純化結果

由圖3和圖4可以看出，經(jīng)過孢子分離得到的菌種純化后污染情況較少，菌絲生長旺盛、茂密，可以證明孢子分離母種的純化效果更好一些。

2.4 羊肚菌菌絲體顯微鏡下觀察

顯微下觀察標準的羊肚菌菌絲體形態(tài)和分離得到的羊肚菌菌絲體的形態(tài)，見圖5和圖6。

圖5 標準的羊肚菌菌絲體形態(tài)

圖6 分離得到的羊肚菌菌絲體形態(tài)

由圖5和圖6可以看出，經(jīng)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，本試驗篩選得到的羊肚菌菌絲與標準羊肚菌菌絲狀態(tài)基本一致，長勢良好，說明孢子分離得到的菌種是羊肚菌菌種，且菌絲純度較高。

2.5 液體培養(yǎng)結果

對由孢子分離的菌種進行液體培養(yǎng)，經(jīng)22℃，120 r·min-1搖床培養(yǎng)6 d，結果見圖7～圖12。由圖7～圖12可以看出，液體培養(yǎng)初期菌絲逐漸由少變多、形成小球，液體培養(yǎng)中期菌絲球越來越多、越大，后期菌絲球更大，整個培養(yǎng)期間，菌液清澈透明，沒有污染，說明所獲菌種純度較高且具有較強的活性，因此該菌種可進一步用于生產(chǎn)驗證。

圖7 液體培養(yǎng)初期

圖8 液體培養(yǎng)初期

圖9 液體培養(yǎng)中期

圖10 液體培養(yǎng)中期

圖11 液體培養(yǎng)后期

圖12 液體培養(yǎng)后期

3 結論

本試驗采集沈陽農(nóng)業(yè)大學后山的羊肚菌，對其進行了組織分離和孢子分離，結果表明孢子分離法效果較好。通過孢子分離法得到了1株羊肚菌菌株，并進行了純化，純化后菌絲體白色、絨毛狀，整體生長狀態(tài)較好，顯微觀察結果與標準羊肚菌菌絲體形態(tài)相符。液體培養(yǎng)菌絲球大小適宜，密度均勻，整個培養(yǎng)期間，菌液清澈透明，沒有污染，說明所獲菌種純度較高且具有較強的活性，該菌種可進一步用于生產(chǎn)驗證。