瓜蔞薤白配伍抗凝血作用的研究

鄒純才，呂文雅，周雨婷，鄢海燕，陳 華，江 薈

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim）或雙邊栝樓（Trichosanthes rosthornii Harms）的干燥成熟果實(shí)，有寬胸散結(jié)之功效［1］.現(xiàn)代藥理研究表明，瓜蔞具有增加冠脈流量、改善心肌缺血、抗血小板聚集等藥理活性，用于心血管疾病的預(yù)防與治療［2，3］.

薤白為百合科植物小根蒜（Allium macrostemon Bge）主要生長(zhǎng)在高海拔地帶，如吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)的薤白就比較多見.薤白（Allium chinense G.Don）的干燥鱗莖，用于胸痹心痛，脘腹痞滿脹痛，瀉痢后重［1］.薤白具有增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心肌組織、降脂、抗氧化、擴(kuò)張血管、抑制凝血和抗血栓等多種藥理作用［4］.薤白為病癥引經(jīng)藥，在治療胸悶、氣短、心悸等心陽(yáng)不通時(shí)加入薤白能引藥歸心經(jīng)［5］.

瓜蔞薤白配伍使用源自于張仲景的《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》篇.有關(guān)瓜蔞薤白配伍抗凝血的研究少有報(bào)道.為此，本課題通過(guò)對(duì)瓜蔞、薤白及其配伍抗小鼠凝血效果的研究，探討薤白對(duì)瓜蔞抗凝血效果的影響，以期為瓜蔞薤白配伍抗血栓及其機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與儀器

1.1 儀器

EXTECH 365515型電子秒表（上海儀博儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；JW-2017HR高速冷凍離心機(jī)（安徽省嘉文儀器裝備有限公司）；FD5-series freeze dryer（sim international group）.

1.2 試藥

瓜蔞、薤白（河北安國(guó)市御顏坊中藥材公司，批號(hào)均為：20170501）；復(fù)方丹參滴丸（天津天士力制藥股份有限公司，27mg/丸，批號(hào)：20170411）；水合氯醛（上海譜振生物科技有限公司，批號(hào)：20160404）；活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)試盒（液體白陶土）（批號(hào)：20180327，南京建成生物工程研究所）、凝血酶原時(shí)間（PT）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20180327，南京建成生物工程研究所）；其余試劑為分析純.

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠，體重17～20g，雌雄各半，由南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0001.

2 方法

2.1 溶液的制備

（1）瓜蔞溶液的制備.取瓜蔞適量，按料液比1∶10（g/mL）加水回流提取2次，每次1h，合并提取液并減壓回收溶劑，得浸膏（相對(duì)密度1.20），用80%乙醇醇沉后放置36h，取上清液并減壓回收溶劑得浸膏，冷凍干燥24h得瓜蔞提取物.瓜蔞提取物用水溶解，制備瓜蔞溶液備用.

（2）薤白溶液的制備.取薤白適量，按上文溶液的制備方法制備薤白溶液備用.

（3）瓜蔞薤白溶液的制備.取瓜蔞、薤白，按1.5∶1（g∶g）配伍，取配伍后的瓜蔞薤白適量，按上文溶液的制備方法制備瓜蔞薤白溶液備用.

2.2 給藥劑量及實(shí)驗(yàn)分組

每個(gè)測(cè)定指標(biāo)取小鼠110只，隨機(jī)分為11組：空白組、復(fù)方丹參滴丸組（參照復(fù)方丹參滴丸說(shuō)明，按成人60kg給藥0.81g計(jì)，小鼠給藥劑量為：0.12g/kg，陽(yáng)性對(duì)照組）、瓜蔞組（參照《中國(guó)藥典》2015年版，按成人60kg給予瓜蔞提取物0.9g計(jì)，小鼠低、中、高劑量組為：0.15g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg），薤白組（參照《中國(guó)藥典》2015年版，按成人60kg給予薤白提取物0.6g計(jì)，小鼠低、中、高劑量組為：0.1g/kg、0.5g/kg、1.0g/kg），瓜蔞薤白組（參照《中國(guó)藥典》2015年版，按成人60kg給予瓜蔞薤白提取物1.5g計(jì)，小鼠低、中、高劑量組為：0.25g/kg、1.5g/kg、3.0g/kg），每組10只，空白組給予純水，各組每日灌胃一次，灌胃容量0.5mL/20g，連續(xù)灌胃7d.

2.3 瓜蔞、薤白及瓜蔞薤白配伍對(duì)小鼠出血時(shí)間（bleeding time，BT）的影響

小鼠于末次給藥前12h，禁食不禁水，末次給藥1h后，固定小鼠，于小鼠尾尖3mm處切斷并計(jì)時(shí)，每隔30s用濾紙檢一次至出血停止為BT［6］.

2.4 瓜蔞、薤白及瓜蔞薤白配伍對(duì)小鼠凝血時(shí)間（clotting time，CT）的影響

小鼠于末次給藥前12h，禁食不禁水，末次給藥后1h，用玻璃毛細(xì)管插入小鼠內(nèi)眥靜脈叢至血柱達(dá)5cm后計(jì)時(shí)，每隔30s折斷一小段至出現(xiàn)血凝絲的時(shí)間即為 CT［6］.

2.5 凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）的測(cè)定

小鼠于末次給藥前12h，禁食不禁水，末次灌胃1h后，摘眼球取血，枸櫞酸鈉抗凝，搖勻，1000r/min離心15min制備血漿，按試劑盒的方法測(cè)定.

2.6 活化部分凝血酶原時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）的測(cè)定［6］

血漿制備同“2.5”，按試劑盒方法測(cè)定.

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著性.

3 結(jié)果

3.1 瓜蔞、薤白及瓜蔞薤白配伍對(duì)小鼠BT、CT的影響

按“2.3”的方法分別測(cè)定瓜蔞、薤白及瓜蔞薤白配伍對(duì)小鼠凝血及出血時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和活化部分凝血酶原時(shí)間的影響.結(jié)果見表1.

與空白組比較，復(fù)方丹參滴丸組及各給藥組均可延長(zhǎng)小鼠BT時(shí)間（P＜0.01）；除薤白組外，復(fù)方丹參滴丸組及各給藥組均可延長(zhǎng)小鼠CT時(shí)間（P＜0.01）.與同劑量的瓜蔞薤白組比較，瓜蔞組及薤白組在延長(zhǎng)小鼠BT時(shí)間上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.瓜蔞薤白組在延長(zhǎng)小鼠CT時(shí)間上明顯優(yōu)于同劑量薤白組，且中、低劑量組有顯著性差異（P＜0.01）.

表1 瓜蔞、薤白及瓜蔞薤白配伍對(duì)小鼠BT、CT的影響（xˉ±s，n=10）

3.2 瓜蔞、薤白及瓜蔞薤白配伍對(duì)小鼠PT、APTT的影響

按“2.4”“2.5”和“2.6”的方法，分別測(cè)定瓜蔞、薤白及瓜蔞薤白配伍對(duì)小鼠凝血及出血時(shí)間的影響、凝血酶原時(shí)間和活化部分凝血酶原時(shí)間.結(jié)果見表2.與空白組比較，復(fù)方丹參滴丸組及各給藥組均可延長(zhǎng)小鼠PT時(shí)間（P＜0.01）；復(fù)方丹參滴丸組及各給藥組均可延長(zhǎng)小鼠APTT時(shí)間（P＜0.01）.與同劑量的瓜蔞薤白組比較，瓜蔞組在延長(zhǎng)小鼠PT及APTT時(shí)間上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.瓜蔞薤白組在延長(zhǎng)小鼠PT時(shí)間上明顯優(yōu)于同劑量薤白組，且中、低劑量組有顯著性差異（P＜0.01）；瓜蔞薤白組在延長(zhǎng)小鼠APTT時(shí)間上明顯優(yōu)于同劑量薤白組，且高、低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）.

表2 瓜蔞、薤白及瓜蔞薤白配伍對(duì)小鼠PT、APTT的影響（xˉ±s，n=10）

4 討論

目前，臨床常用的抗血小板藥物主要有：阿司匹林、氯吡格雷、阿昔單抗等［6］，但不良反應(yīng)較多［7］，作用機(jī)制單一，部分人群對(duì)阿司匹林和氯吡格雷抵抗或反應(yīng)性低.為此，尋找高效安全的抗血小板藥物仍為各國(guó)研究者關(guān)注的重點(diǎn).

劉岱琳等利用體外抗血小板聚集的活性測(cè)試體系對(duì)從瓜蔞中分離出的化合物進(jìn)行了測(cè)定，證實(shí)了瓜蔞中存在抗血小板聚集物質(zhì)，如腺苷等［3］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了瓜蔞的抗凝血作用.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瓜蔞由低劑量到中劑量呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，但當(dāng)達(dá)到高劑量后，BT、CT、PT、APTT四項(xiàng)指標(biāo)均未延長(zhǎng).

現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，薤白具有抑制凝血和抗血栓等多種藥理作用.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，薤白由低劑量到高劑量呈現(xiàn)量效關(guān)系.

本實(shí)驗(yàn)在探討瓜蔞、薤白兩味藥單獨(dú)使用抗凝血作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了瓜蔞薤白配伍的抗凝血作用.瓜蔞薤白按1.5∶1配伍后其抗凝效果低劑量到中劑量呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，但當(dāng)達(dá)到高劑量后，BT、CT、PT、APTT四項(xiàng)指標(biāo)均未延長(zhǎng).與同劑量瓜蔞薤白組比較，瓜蔞組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；瓜蔞薤白組在延長(zhǎng)小鼠CT時(shí)間上明顯優(yōu)于同劑量薤白組，且中、低劑量組有顯著性差異（P＜0.01）.瓜蔞薤白組在延長(zhǎng)小鼠APTT時(shí)間上明顯優(yōu)于同劑量薤白組，且高、低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）.

綜上所述，瓜蔞、薤白均具有抗凝血作用，瓜蔞薤白配伍的抗凝血作用以瓜蔞為主，薤白為輔.