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      楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

      2018-12-04 06:27:12鄒亞麗唐慧安李長江呼麗萍王弋博
      關(guān)鍵詞:波糖糖苷酶配位

      鄒亞麗,唐慧安,李長江,呼麗萍,王弋博

      (1.天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院,天水師范學(xué)院新型分子材料設(shè)計(jì)與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅大櫻桃工程技術(shù)研究中心,甘肅 天水 741001;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué),江西 南昌 330045)

      近20年來,糖尿病發(fā)病率迅速上升,以2型糖尿?。═2DM)更甚。[1]臨床上T2DM主要用阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇為代表的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物進(jìn)行治療,其作用機(jī)理是形成酶-抑制劑復(fù)合物而使酶失活以阻礙碳水化合物的代謝,控制血糖含量。這類化合物具有一定的副作用,表現(xiàn)為:長期服用阿卡波糖等藥物后會(huì)產(chǎn)生腸胃脹氣,惡心、腹痛、胃疼等腸胃不良癥狀,還產(chǎn)生肝損害和藥物性肝炎等毒副作用。[2-4]近年來研究發(fā)現(xiàn)釩化合物能增加機(jī)體組織對(duì)胰島素的敏感性,具有抗糖尿病、抗腫瘤及神經(jīng)保護(hù)等多方面功能,且有機(jī)釩配合物的降糖效果優(yōu)于無機(jī)釩化合物,[5]但呋喃甲酸類氧釩[6]及氧釩羧酸類配合物也有一定的胃腸道毒副反應(yīng),[7]高劑量的釩還可能使釩蓄積在線粒體內(nèi),抑制線粒體呼吸功能氧化應(yīng)激和呼吸抑制導(dǎo)致機(jī)體中毒,[8]因此低毒的有機(jī)羧酸或有抗糖尿病活性的有機(jī)藥物為配體的釩配合物,已成為目前釩配合物降糖的熱點(diǎn)之一。研究表明黃酮配合物可作為抗氧化劑減輕或消除釩對(duì)線粒體的毒性作用,消除釩配合物對(duì)細(xì)胞連接的破壞,[9-10]本研究基于此采用化學(xué)方法合成了楊梅黃酮合氧釩,以紫外光譜、紅外光譜等手段對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,并探究了其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用和其酶催化動(dòng)力學(xué)特征。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      α-葡萄糖苷酶(美國Sigma公司),阿卡波糖(上海史瑞可生物有限公司);二甲雙胍(Sell?ick公司),4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG,上海葉源生物);3,5-二硝基水楊酸、苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉等藥品均為上海生工產(chǎn)品;楊梅黃酮(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司),紫外分光光度計(jì)(lambda35,PerkinEl?mer),傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 6700,Thermo Fisher),酶標(biāo)儀 (Multiskan FC,Thermo Fisher)

      1.2 合成方法

      將2.9697g(0.0162mol)V2O5與6.06 mLH2SO4(17.35 mol/L,0.105mol)加入圓底燒瓶,90℃加熱并攪拌60min.冷卻加少量蒸餾水稀釋,加入1.4694g(0.0162mol)H2C2O4,加熱并攪拌,反應(yīng)溫度60℃,時(shí)間10h,得硫酸氧釩溶液。然后將26.8191g(0.1050mol)Ba(Ac)2配成溶液,邊攪拌邊滴加到硫酸氧釩溶液中,過濾后將其加熱濃縮后置于50℃電熱真空干燥箱24h得醋酸氧釩晶體。將0.3182(1mmol)楊梅黃酮與50mL乙醇加入圓底燒瓶,升溫至65℃加熱并攪拌60min,到楊梅黃酮完全溶解,緩慢滴加50mL含0.1190g(0.5mmol)醋酸氧釩的無水乙醇溶液后,緩慢加入10 mL乙醇鈉溶液,65℃回流反應(yīng)3h,出現(xiàn)褐色沉淀,過濾洗滌,將生成物置于50℃真空干燥箱內(nèi)干燥24h,得楊梅黃酮合氧釩,其結(jié)構(gòu)式如下:

      1.3 結(jié)構(gòu)表征

      圖1 楊梅黃酮(a)和楊梅黃酮合氧釩配合物(b)結(jié)構(gòu)

      配合物采用KBr壓片法,在400~4000cm-1范圍內(nèi)炒采集楊梅黃酮及楊梅黃酮合氧釩配合物的紅外光譜;取一定量楊梅黃酮及楊梅黃酮合氧釩配合物溶于丙酮中,溶液濃度在10-4mol/L以下,在200~500 nm范圍內(nèi)掃描。

      1.4 楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其催化動(dòng)力學(xué)研究

      取20μL 2mg/mL楊梅黃酮合氧釩,加入pNPG(0.116 mol/L)20μL,混勻,37℃水浴恒溫60min,反應(yīng)液中再加入α-葡萄糖苷酶0.1U/mL 50μL,37℃水浴恒溫30min,最后加入1mol/L的Na2CO3溶液100μL,終止反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀在405nm波長下測(cè)定OD值。空白組磷酸鹽PBS緩沖液(0.2mol/mL,pH6.8)代替酶液,對(duì)照組以二甲基亞砜代替樣液,阿卡波糖為陽性參照物,根據(jù)公式計(jì)算各濃度下α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制率。[11]

      式中:A為樣品的吸光值;A’為樣品空白吸光值;A0為對(duì)照組吸光值;A0’為對(duì)照組空白吸光值。

      采用Line weaver-Burk曲線作圖法判斷楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型,固定α-葡萄糖苷酶溶液濃度,分別改變pNPG濃度(2.5、5、7.5、10μmol/mL)及楊梅黃酮合氧釩水溶液濃度(0.8、1.2、1.6 mg/m L),以 1/v對(duì) 1/[S]作圖,得到Lineweaver-Burk曲線(見圖6)。[11]

      1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(X±s)的形式表示,采用LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 楊梅黃酮合氧釩結(jié)構(gòu)表征分析

      2.1.1 紅外光譜分析

      楊梅黃酮和楊梅黃酮合氧釩的紅外吸收光譜見圖2(a)和2(b)。由圖2(a)和2(b)可知,二者的紅外吸收光譜明顯不同,楊梅黃酮在3410cm-1處峰形尖銳,歸屬為νO-H的伸縮振動(dòng),而楊梅黃酮合氧釩在3369cm-1處出現(xiàn)較寬鈍的νO-H吸收峰,且強(qiáng)度增加,原因是楊梅黃酮酚羥基與配位水分子形成氫鍵,使νO-H向低頻移動(dòng),且強(qiáng)度增加。在515cm-1出現(xiàn)了配位水的振動(dòng)吸收,進(jìn)一步佐證了配合物中配位水的存在。楊梅黃酮4號(hào)位羰基在1660cm-1處有吸收峰,而楊梅黃酮合氧釩則在1595cm-1處有吸收峰,向低波數(shù)移動(dòng)了65cm-1,表明配體4號(hào)位羰基與釩原子配位成鍵。楊梅黃酮在1200cm-1處出現(xiàn)峰,歸屬為酚羥基νC-O的伸縮振動(dòng),楊梅黃酮合氧釩移至1112cm-1,向低波數(shù)移動(dòng)了88cm-1,原因是楊梅黃酮酚羥基提供電子與釩離子配位;楊梅黃酮合氧釩在614cm-1新出現(xiàn)的峰歸屬為V-O鍵的伸縮振動(dòng),進(jìn)一步表明配體與釩陽離子間配位鍵的形成。

      圖2 楊梅黃酮(a)和楊梅黃酮合氧釩(b)紅外圖譜

      2.1.2 紫外光譜分析

      楊梅黃酮和楊梅黃酮合氧釩紫外光譜見圖3(a)和3(b)。楊梅黃酮在200~500nm范圍存在兩個(gè)主要紫外吸收帶,最大吸收波長分別為210nm和373nm,而楊梅黃酮氧釩的兩個(gè)紫外吸收帶則均向長波方向移動(dòng),最大吸收波長分別為238nm和423nm;分別由210nm移至238nm和由373nm移至423nm,且在357.5nm處出現(xiàn)新峰,這表明楊梅黃酮氧釩對(duì)楊梅黃酮B環(huán)共軛效應(yīng)增強(qiáng)較大,對(duì)A環(huán)的影響相對(duì)較小。據(jù)紅外光譜可知,A環(huán)羰基是參與配位的,又從楊梅黃酮的結(jié)構(gòu)式可看出,另一個(gè)參與配位的可以是3-羥基,也可以是5-羥基。因3-羥基是與B環(huán)共軛,而5-羥基與A環(huán)共軛,且楊梅黃酮氧釩配合物對(duì)B環(huán)共軛效應(yīng)增強(qiáng)較大,因此可判斷是楊梅黃酮的3-羥基而非5-羥基參與配位。

      圖3 楊梅黃酮(a)和楊梅黃酮合氧釩(b)紫外圖譜

      2.2 楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其酶催化動(dòng)力學(xué)特征

      由圖4所示,隨著楊梅黃酮合氧釩濃度的增大,其對(duì)a-葡萄糖苷酶活性的抑制作用也逐漸增強(qiáng),楊梅黃酮合氧釩濃度為0.4 mg/mL時(shí)對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制率高,達(dá)到91.91%,是同濃度下陽性對(duì)照阿卡波糖抑制率的2.45倍,通過計(jì)算得到其IC50為271mg/L.

      研究表明天然黃酮類活性成分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有顯著抑制作用,[12-13]本研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率顯著高于阿卡波糖(p<0.005)。劉合生等對(duì)比了楊梅素、楊梅苷和氯化矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用,發(fā)現(xiàn)三者中楊梅苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用最弱,楊梅苷疏水性的降低可能減弱了它與酶的親和力。[14]本研究中合成的楊梅黃酮合氧釩B環(huán)3′4′5′攜帶3個(gè)羥基,且是雙核黃酮氧釩配合物,由于共軛效應(yīng),表現(xiàn)出較強(qiáng)供電性,同時(shí)金屬配位原子的協(xié)同效應(yīng),亦增強(qiáng)了楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果。

      圖5 楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線

      對(duì)楊梅黃酮合氧釩抑制α-葡萄糖苷酶作用進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析,Lineweaver-Burk曲線結(jié)果表明,當(dāng)楊梅黃酮合氧釩濃度增加時(shí),抑制作用的表觀Km值增大,Vmax不變,說明楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型屬于典型的競爭性抑制,其競爭性抑制作用的強(qiáng)弱取決于抑制劑與底物競爭酶的濃度,表明楊梅黃酮合氧釩與α-葡萄糖苷酶的底物pNPG有結(jié)構(gòu)上的相似性,能與pNPG競相爭奪α-葡萄糖苷酶分子上的結(jié)合位點(diǎn),從而產(chǎn)生酶活性的可逆的抑制作用,而劉合生等研究發(fā)現(xiàn)楊梅苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制為混合型競爭,可能與楊梅苷3號(hào)位碳原子形成鼠李糖苷有關(guān)。[14]

      3 結(jié) 論

      本研究合成了新型有機(jī)氧釩的配合物楊梅黃酮合氧釩,通過紅外光譜、紫外光譜對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征,楊梅黃酮合氧釩可抑制α-葡萄糖苷酶活性,其抑制率達(dá)95.60%,其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型屬于的競爭性抑制,構(gòu)效關(guān)系表明,楊梅黃酮合氧釩A環(huán)含有3個(gè)游離羥基,且C環(huán)3號(hào)位羥基具有更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性,由于含有金屬釩可改善胰島素抵抗,[15]且楊梅黃酮合氧釩能提高釩的溶解性,因此是一種有前景的新型α-葡萄糖苷酶抑制劑。

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