葉冠雄 秦勇 王世

[摘要] 目的 探討miR-122調(diào)控LAMC1表達(dá)與肝癌細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)性研究。 方法 選取人正常肝細(xì)胞株LO2、肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，構(gòu)建 miR-122 mimics穩(wěn)定表達(dá)載體并對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Real-Time PCR檢測各組細(xì)胞株內(nèi)microRNA-122含量；CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力；生物信息學(xué)預(yù)測、熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)Real-Time PCR檢測層粘連蛋白γ1（Recombinant laminin gamma 1，LAMC1）mRNA水平變化。 結(jié)果 與對照組人正常肝細(xì)胞株LO2相比，miR-122過表達(dá)后，肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，LAMC1 mRNA含量顯著降低，肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 上調(diào)miR-122表達(dá)可通過調(diào)控LAMC1表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

[關(guān)鍵詞] 小分子核糖核酸-122；肝癌；LAMC1；遷移；侵襲

[中圖分類號] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）22-0027-05

[Abstract] Objective To investigate the correlation between LAMC1 expression regulated by miR-122 and tumor cell migration and invasion. Methods Human normal hepatocyte cell line LO2， HepG2 cell line and SMMC-7721 cell line with high metastatic potential were selected， and the stable miR-122 mimics expression vector was constructed and transfected. Real-Time PCR was used to detect the expression of microRNA-122； Cell viability was detected by CCK-8 assay； Cell apoptosis was detected by flow cytometry； Scratch assay was used to detect the migration and invasion ability of hepatocellular carcinoma cell； Bioinformatics prediction and fluorescence reporter assay Real-Time PCR detected Protein γ1 （Recombinant Laminin Gamma 1， LAMC1） mRNA level changes. Results Compared with the normal human hepatocyte cell line LO2， the survival rate of HepG2 cells and SMMC-7721 cell lines with high metastatic potential were significantly decreased after miR-122 was overexpressed， and the apoptosis rate was significantly increased. The mRNA levels of HepG2 and SMMC-7721 were significantly decreased. The cell migration and invasion ability of HepG2 and SMMC-7721 were significantly decreased. The difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The up-regulation of miR-122 expression can inhibit the proliferation， migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells by regulating the expression of LAMC1.

[Key words] Small molecule RNA-122； Liver cancer； LAMC1； Migration； Invasion

原發(fā)性肝癌是一種常見的嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來在世界范圍內(nèi)逐年上升，嚴(yán)重危害患者的生命健康[1，2]。肝癌起病隱匿，臨床早期無明顯的癥狀或臨床癥狀缺乏特異性；同時肝癌發(fā)病進(jìn)展迅速，具有高侵襲性和高復(fù)發(fā)性，導(dǎo)致其臨床治療難度大，預(yù)后極差[3-5]。microRNAs近年來已經(jīng)發(fā)展為一個生物腫瘤治療領(lǐng)域的新靶點(diǎn)。microRNAs作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，其廣泛參與并有效涉及多種生物及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡代謝等過程[6-8]。miR-122作為肝臟特異性表達(dá)的microRNAs，其過表達(dá)可有效降低肝癌細(xì)胞的特異性，抑制肝癌細(xì)胞的分化周期，并能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對藥物的敏感性，但其對于肝癌細(xì)胞的具體調(diào)控機(jī)制仍未闡明[9-12]。本研究中，我們通過上調(diào)肝癌細(xì)胞內(nèi)miR-122表達(dá)，分析檢測其對肝癌細(xì)胞的增殖凋亡和遷移侵襲的影響，旨在探討miR-122對肝癌細(xì)胞遷移侵襲的調(diào)節(jié)作用和其對肝癌細(xì)胞內(nèi)層粘連蛋白γ1（LAMC1）調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

美國培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，Manassas，VA）購買人正常肝細(xì)胞株LO2、肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721。miR-122質(zhì)粒、LAMC1及Real-Time-PCR配套引物（廣州RiboBio公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；TUNEL凋亡試劑盒（上海碧云天生物有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常肝細(xì)胞株LO2和肝癌細(xì)胞株HepG2用DMEM+10%胎牛血清、37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞用RMPI 1640+10%胎牛血清、37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3種細(xì)胞正常傳代后提取細(xì)胞樣品、PBS洗滌2次后轉(zhuǎn)移入EP管中，冰上裂解15 min后超聲破碎細(xì)胞，離心15 min，取上清液作為蛋白樣品。

1.3 細(xì)胞miR-122mimics質(zhì)粒轉(zhuǎn)染[13]

慢病毒質(zhì)粒（Lv-miR-122）與對照scarmble RNA的病毒質(zhì)粒（Lv-Ctrl）連同包裝質(zhì)粒pRRE、pRSV-REV、pCMV-VSVG通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)到293T細(xì)胞，48 h收集上清液，冷凍超速離心獲得病毒濃縮液。人正常肝細(xì)胞株LO2、肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721接種于12孔板加入病毒上清液和polybrene（8 μg/mL） 選擇感染16 h后更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）為熒光標(biāo)記慢病毒感染，72 h時用熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因的表達(dá)情況，熒光率即為陽性感染率。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

將轉(zhuǎn)染后的人正常肝細(xì)胞株LO2、肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液并接種到96孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。加入10 μL CCK8，按說明書操作進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和測定450 nm波長處OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 TUNEL流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

將轉(zhuǎn)染后的人正常肝細(xì)胞株LO2、肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞制備成濃度為1×106細(xì)胞懸液接種于6孔板中培養(yǎng)，分別加入FITc標(biāo)記的AnnexinV和PI，按試劑盒說明書進(jìn)行操作和測定激發(fā)波長488 nm，收集波長630 nm的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，檢測肺癌細(xì)胞的凋亡百分比。

1.6 Real-Time PCR方法檢測miR-122和LAMC1水平變化

將轉(zhuǎn)染后的人正常肝細(xì)胞株LO2、肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞制備成濃度為1×106細(xì)胞懸液接種于6孔板中培養(yǎng)，Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒擴(kuò)增和實(shí)時熒光定量Real-time PCR分析。分析：通過計(jì)算miR-122和LAMC1基因的循環(huán)閾值（CT值）確定各個基因的表達(dá)含量。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)細(xì)胞遷移和侵襲[14]

取人正常肝細(xì)胞株LO2、肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞及miR-122病毒轉(zhuǎn)染后的3種細(xì)胞接種于96孔板上，第2天更換低濃度血清培養(yǎng)基，將劃痕儀對準(zhǔn)96孔板的下端中央部位，向上輕推形成劃痕。用無血清培養(yǎng)基輕輕漂洗2～3遍，加入低濃度血清培養(yǎng)基（如0.5%FBS），37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察24 h后細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

1.8 miR-122靶基因預(yù)測[15]

應(yīng)用TargetScanHuman、FindTar等生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-122的靶基因。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)比較，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞內(nèi)miR-122的表達(dá)量

對照組人正常肝細(xì)胞株LO2 miR-122的表達(dá)量（1.00±0.00）相比，肝癌細(xì)胞株HepG2 miR-122的表達(dá)量（0.79±0.06）和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)miR-122的表達(dá)量（0.64±0.05）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=482.50，P=0.00）。見圖1。

2.2 miR-122過表達(dá)對肝癌細(xì)胞存活率的影響

與對照組人正常肝細(xì)胞株LO2相比，miR-122過表達(dá)后，肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=523.60，P<0.05）。見圖2，表1。

2.3 miR-122過表達(dá)對肝癌細(xì)胞凋亡率的影響

與對照組人正常肝細(xì)胞株LO2相比，miR-122過表達(dá)后，肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2418，P<0.05）。見圖3，表2。

2.4 miR-122靶基因預(yù)測及其過表達(dá)對細(xì)胞LAMC1 mRNA影響

檢索miR-122靶基因數(shù)據(jù)庫TargetScan分析發(fā)現(xiàn)，LAMC1與miR-122具有結(jié)合位點(diǎn)，這提示LAMC1是miR-122潛在的靶基因，應(yīng)用熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染試驗(yàn)分析可知，野生型LAMC1 mRNA含量為（1.12±0.23），miR-122過表達(dá)后LAMC1 mRNA含量為（0.61±0.37）；突變型LAMC1 mRNA含量為（1.11±0.26），miR-122過表達(dá)后LAMC1 mRNA含量為（0.94±0.43）；過表達(dá)miR-122能夠直接作用于野生型LAMC1 3′UTR的特定序列，并對LAMC1起到負(fù)性調(diào)控作用，表明LAMC1是miR-122的靶基因，miR-122過表達(dá)后野生型LAMC1 mRNA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.41，P=0.00）。見圖4、圖5，表3。

2.5 miR-122過表達(dá)對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

與對照組人正常肝細(xì)胞株LO2相比，miR-122過表達(dá)后，肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見封三圖3。

3 討論

細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用主要是通過粘著斑與細(xì)胞外基質(zhì)相連接的應(yīng)力纖維而成。細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞外環(huán)境的重要組成成分，通過激活細(xì)胞因子和生長因子參與調(diào)控細(xì)胞信號通路[16-18]。細(xì)胞外基質(zhì)主要包括糖胺聚糖、結(jié)構(gòu)蛋白和粘著蛋白，這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動。其中纖粘連蛋白和層粘連蛋白能夠促使細(xì)胞同基質(zhì)結(jié)合。其中以膠原和蛋白聚糖為基本骨架在細(xì)胞表面形成纖維網(wǎng)狀復(fù)合物，這種復(fù)合物通過纖粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白以及其他的連接分子直接與細(xì)胞表面受體連接，或附著到受體上。由于受體多數(shù)是膜整合蛋白，并與細(xì)胞內(nèi)的骨架蛋白相連，所以細(xì)胞外基質(zhì)通過膜整合蛋白將細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)連成了一個整體。層粘連蛋白LAMC1是一種細(xì)胞外基質(zhì)的重要調(diào)節(jié)因子，廣泛存在于細(xì)胞膜的基底膜帶中。其生物功能是細(xì)胞黏著于基質(zhì)的介質(zhì)，并與多種基底膜成分結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化。LAMC1可通過與細(xì)胞間的相互作用直接或間接的影響細(xì)胞的活動，如細(xì)胞粘附與轉(zhuǎn)移、增殖與凋亡、分化與極化等明顯相關(guān)[19，20]。研究表明，層粘連蛋白-1具有增強(qiáng)細(xì)胞間粘附的作用，LAMC1通過與細(xì)胞間的相互作用可直接或間接控制細(xì)胞的活動，其表達(dá)可明顯調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展、癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

本研究表明，肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721內(nèi)miR-122含量顯著降低，說明在肝癌細(xì)胞中miR-122呈低表達(dá)狀態(tài)。上調(diào)miR-122表達(dá)后，肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，且在高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞的表現(xiàn)更為明顯，說明miR-122過表達(dá)可有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖和分化，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡發(fā)生。同時，肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721過表達(dá)miR-122后，細(xì)胞內(nèi)LAMC1 mRNA含量顯著降低，肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著下降，說明miR-122可對肝癌細(xì)胞內(nèi)靶基因LAMC1起到負(fù)性調(diào)控作用，影響肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，外周血miR-214基因的異常表達(dá)可明顯提示患者肺癌疾病情況；同時，肺癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-214基因可顯著調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖及凋亡能力，并對肺癌細(xì)胞的多藥耐藥能力具有一定的影響。上調(diào)miR-122表達(dá)可有效抑制肝癌細(xì)胞株HepG2和高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的分化增殖及凋亡能力，遷移能力和侵襲能力。且肝癌細(xì)胞內(nèi)LAMC1為miR-122作用的靶基因。本研究將為臨床應(yīng)用miR-122基因治療肝癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但miR-122是否還可通過調(diào)控其他靶基因來共同作用，仍需進(jìn)一步探究。

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（收稿日期：2018-01-02）