潘媛， 彭成， 江虹雨， 岳美穎， 唐光梅， 謝曉芳

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都610075)

樟柳堿是從唐古特東莨菪堿植物中提取的一種抗膽堿能藥，藥理作用廣泛，以對神經(jīng)系統(tǒng)的作用為主(彭建中，金麗容，1982)，其次有抗心肌缺血(陳錦明等，1983)、抗肺急性損傷(王火等，1999)、抗腎損傷(吳廣禮等，2002)、抗胃潰瘍(張建福等，1990)、抗組胺受體(詹皓等，1987)等作用。在臨床上，氫溴酸樟柳堿可用于偏頭痛、血管性頭痛等，且早在1975年就有用于偏頭痛的臨床報(bào)道(四川醫(yī)學(xué)院附院神經(jīng)科，徐州醫(yī)學(xué)院附院神經(jīng)科，1975)。依據(jù)偏頭痛的血管源學(xué)說，認(rèn)為顱內(nèi)動脈收縮引起先兆，然后顱外血管擴(kuò)張，血管周圍組織產(chǎn)生血管活性物質(zhì)導(dǎo)致無菌性炎癥而誘發(fā)頭痛。但氫溴酸樟柳堿對血管的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究氫溴酸樟柳堿對離體血管環(huán)的作用，擬初步明確氫溴酸樟柳堿對血管收縮舒張功能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

氫溴酸樟柳堿(高效液相色譜純度>98.5%)原料藥由成都第一制藥提供，生產(chǎn)批號：14120，臨用前精密稱取氫溴酸樟柳堿0.301 8 g用超純水溶解至1.5 mL，配置成0.5 mol·L-1的氫溴酸樟柳堿母液；苯腎上腺素(phenylephrine，PHE；Sigma)，生產(chǎn)批號：1000957684；左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME；Sigma)，生產(chǎn)批號：10093568；乙酰膽堿(acetylcholine，Ach；Bomei)，生產(chǎn)批號：A0041；格列本脲(glyburide，Gly；Sigma)，生產(chǎn)批號：1001896356；4-氨基吡啶(4-Aminopyridine，4-AP；Sigma)，生產(chǎn)批號：1001809775；四乙基氯化銨(tetraethylammonium chloride，TEA；Sigma)，生產(chǎn)批號：1000940891。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級成年健康雌性或雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-15，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(川)2008-049。飼養(yǎng)溫度21～27 ℃，濕度50%±5%，晝夜光照及通風(fēng)環(huán)境自然調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照動物管理章程。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

HH-4型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，F(xiàn)A2004B型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)，D2-8實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)(成都寶塞思科技有限公司)，可調(diào)式移液器(Thermo Fisher Scientific)，低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)，M870B5/10型離體組織灌流系統(tǒng)、ML870型PowerLab生物信號采集系統(tǒng)、MLT0201型張力換能器、LabchartPro均購自埃德儀器國際貿(mào)易(上海)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠頸總動脈環(huán)的制備

用10%水合氯醛麻醉大鼠，然后快速取出其頸總動脈，并置于O2飽和且持續(xù)通入95%O2+5%CO2的4 ℃的K-H液(NaCl：118.4 mmol·L-1，KCl：4.7 mmol·L-1，CaCl2：2.5 mmol·L-1，KH2PO4：1.2 mmol·L-1，MgSO4：1.2 mmol·L-1，Na2HCO3：25.0 mmol·L-1，C6H12O6：10.1 mmol·L-1，乙二胺四乙酸：0.03 mmol·L-1；pH7.4)，剔除周圍的結(jié)締組織，剪成大約3 mm的血管環(huán)，并用2根針灸針制成的掛鉤水平懸掛于浴管內(nèi)，一端固定于浴管內(nèi)，另一端連接張力換能器，并將前負(fù)荷調(diào)節(jié)為0.8 g，使用PowerLab生物信號采集系統(tǒng)采集和記錄張力的變化。浴槽內(nèi)含有K-H液，恒溫37 ℃，持續(xù)不斷通入95%O2+5%CO2，每15 min換一次預(yù)熱到37 ℃的K-H液，共平衡60 min。此后，用90 mmol·L-1KCl連續(xù)刺激大鼠頸總動脈環(huán)連續(xù)2次，每次40 min，以誘發(fā)最大張力。刺激后，用預(yù)熱到37 ℃的K-H液連續(xù)沖洗3次，每次5 min，待恢復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)后，調(diào)節(jié)前負(fù)荷至0.8 g，再穩(wěn)定30～60 min。當(dāng)連續(xù)相同刺激所引起的頸總動脈環(huán)血管收縮幅度差小于10%時(shí)，認(rèn)為血管穩(wěn)定，可以開始實(shí)驗(yàn)(胡冠英，2015)。

2.2 血管環(huán)去內(nèi)皮檢測

將削好的牙簽穿過制備好的血管環(huán)內(nèi)腔，輕輕旋轉(zhuǎn)，以機(jī)械力去除其內(nèi)皮。再用1 μmol·L-1PHE收縮血管環(huán)，待收縮張力達(dá)到坪值(即張力不再上升)后，往槽內(nèi)加入10 μmol·L-1Ach舒張血管環(huán)，若舒張幅度大于80%，則認(rèn)為內(nèi)皮完整；若舒張幅度小于10%，則認(rèn)為去內(nèi)皮成功。

2.3 氫溴酸樟柳堿對KCl預(yù)收縮血管環(huán)的影響

將符合實(shí)驗(yàn)條件的血管環(huán)隨機(jī)分為KCl預(yù)收縮對照組(n=8)、KCl預(yù)收縮加氫溴酸樟柳堿組(n=8)。血管環(huán)穩(wěn)定后，往浴槽內(nèi)加入90 mmol·L-1KCl預(yù)收縮，當(dāng)血管環(huán)收縮張力達(dá)到坪值時(shí)(約40 min)，向浴槽內(nèi)累積加入氫溴酸樟柳堿(1×10-4～5×10-3mol·L-1)或?qū)φ談?K-H液)，建立氫溴酸樟柳堿濃度依賴舒張效應(yīng)曲線，觀察和比較不同濃度氫溴酸樟柳堿對90 mmol·L-1KCl預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用。以90 mmol·L-1KCl所致的血管環(huán)最大收縮張力為100%，計(jì)算各濃度下氫溴酸樟柳堿所致的舒張百分比。

2.4 氫溴酸樟柳堿對PHE預(yù)收縮血管環(huán)的影響

將符合實(shí)驗(yàn)條件的血管環(huán)隨機(jī)分為PHE預(yù)收縮對照組(n=8)、PHE預(yù)收縮加氫溴酸樟柳堿組(n=8)。血管環(huán)穩(wěn)定后，往浴槽內(nèi)加入1 μmol·L-1PHE預(yù)收縮，當(dāng)血管環(huán)的收縮張力達(dá)到坪值時(shí)(約20 min)，向浴槽內(nèi)累積加入氫溴酸樟柳堿(1×10-4～5×10-3mol·L-1)或?qū)φ談?K-H液)，建立氫溴酸樟柳堿濃度依賴舒張效應(yīng)曲線，觀察和比較不同濃度氫溴酸樟柳堿對1 μmol·L-1PHE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用。以1 μmol·L-1PHE所致的血管環(huán)最大收縮張力為100%，計(jì)算各濃度下氫溴酸樟柳堿所致的舒張百分比。

2.5 氫溴酸樟柳堿對PHE預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的血管環(huán)的影響

將符合實(shí)驗(yàn)條件的血管環(huán)隨機(jī)分為PHE預(yù)收縮加氫溴酸樟柳堿組(n=8)、去內(nèi)皮組(n=8)。取去內(nèi)皮的血管環(huán)，待血管環(huán)穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)加入1 μmol·L-1PHE預(yù)收縮，當(dāng)血管環(huán)收縮張力達(dá)到坪值時(shí)(約20 min)，向浴槽內(nèi)累積加入氫溴酸樟柳堿(1×10-4～5×10-3mol·L-1)，建立氫溴酸樟柳堿的濃度依賴舒張效應(yīng)曲線，觀察和比較不同濃度下氫溴酸樟柳堿對1 μmol·L-1PHE預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的血管環(huán)的舒張作用。分別以1 μmol·L-1PHE對內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的血管環(huán)所致的最大收縮張力為100%，分別計(jì)算各濃度氫溴酸樟柳堿所致的舒張百分比。

2.6 氫溴酸樟柳堿對L-NAME預(yù)孵血管環(huán)的影響

將符合實(shí)驗(yàn)條件的血管環(huán)隨機(jī)分為PHE預(yù)收縮加氫溴酸樟柳堿組(n=8)、L-NAME預(yù)孵組(n=8)。血管環(huán)穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)加入1 μmol·L-1PHE預(yù)收縮，當(dāng)血管環(huán)收縮張力達(dá)到坪值時(shí)(約20 min)，再加入1×10-4mol·L-1L-NAME預(yù)孵20 min，向浴槽內(nèi)累積加入氫溴酸樟柳堿(1×10-4～5×10-3mol·L-1)，建立氫溴酸樟柳堿濃度依賴舒張效應(yīng)曲線，在1 μmol·L-1PHE預(yù)收縮的基礎(chǔ)上，觀察和比較各濃度氫溴酸樟柳堿對L-NAME預(yù)孵血管環(huán)的舒張作用。以1 μmol·L-1PHE對血管環(huán)所致的最大收縮張力為100%，計(jì)算各濃度氫溴酸樟柳堿對L-NAME預(yù)孵血管環(huán)所致的舒張百分比。

2.7 氫溴酸樟柳堿對鉀離子通道阻滯劑預(yù)孵血管環(huán)的影響

將符合實(shí)驗(yàn)條件的血管環(huán)隨機(jī)分為PHE預(yù)收縮加氫溴酸樟柳堿組(n=8)、TEA預(yù)孵組(n=8)、4-AP預(yù)孵組(n=8)、Gly預(yù)孵組(n=8)、BaCl2預(yù)孵組(n=8)。血管環(huán)穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)加入1 μmol·L-1PHE預(yù)收縮，當(dāng)血管環(huán)收縮張力達(dá)到坪值時(shí)(約20 min)，再分別加入鉀離子通道阻滯劑(1×10-2mol·L-1TEA、1×10-3mol·L-14-AP、1×10-5mol·L-1Gly或1×10-4mol·L-1BaCl2)預(yù)孵20 min，向浴槽內(nèi)累積加入氫溴酸樟柳堿(1×10-4～5×10-3mol·L-1)，建立氫溴酸樟柳堿的濃度依賴舒張效應(yīng)曲線，在1 μmol·L-1PHE預(yù)收縮血管環(huán)的基礎(chǔ)上，觀察和比較各濃度氫溴酸樟柳堿對各種鉀離子通道阻滯劑預(yù)孵血管環(huán)的舒張作用。以1 μmol·L-1PHE對血管環(huán)所致的最大收縮張力為100%，計(jì)算各濃度氫溴酸樟柳堿對鉀離子通道阻滯劑預(yù)孵血管環(huán)所致的舒張百分比。

2.8 氫溴酸樟柳堿對血管環(huán)外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放的影響

血管環(huán)穩(wěn)定后，觀察氫溴酸樟柳堿對其外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放的影響。為保證平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+充足，用100 mmol·L-1KCl收縮血管環(huán)。待張力到達(dá)坪值后，用無Ca2+溶液連續(xù)沖洗3次，每次5 min，并用無Ca2+溶液平衡30 min后，浴槽內(nèi)加入氫溴酸樟柳堿2×10-3mol·L-1預(yù)孵血管環(huán)20 min，再加入1 μmol·L-1PHE，血管環(huán)呈現(xiàn)短暫收縮。收縮張力達(dá)到坪值后，繼續(xù)加入3 mmol·L-1CaCl2，血管環(huán)再次出現(xiàn)收縮并達(dá)到峰值，分別觀察在無鈣溶液中氫溴酸樟柳堿預(yù)孵對PHE或CaCl2所致血管環(huán)收縮的抑制作用。

2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 氫溴酸樟柳堿對KCl預(yù)收縮血管環(huán)的影響

氫溴酸樟柳堿可濃度依賴地(1×10-4～5×10-3mol·L-1)舒張KCl預(yù)收縮血管環(huán)，結(jié)果顯示，Emax=33.97%±11.53%，并在低濃度(1×10-4～1×10-3mol·L-1)下有收縮血管的作用(P<0.01，P<0.05)(圖1)。

3.2 氫溴酸樟柳堿對PHE預(yù)收縮血管環(huán)的影響

氫溴酸樟柳堿可濃度依賴地(1×10-4～5×10-3mol·L-1)舒張PHE預(yù)收縮血管環(huán)，結(jié)果顯示，與對照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EC50=5.61(3.88， 8.10) mmol·L-1，Emax=47.93%±18.63%(圖2)。

圖1 氫溴酸樟柳堿對KCl預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響Fig. 1 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of KCl precontracted vascular ring (n=8，

*P<0.05，**P<0.01； 下同， the same below

圖2 氫溴酸樟柳堿對苯腎上腺素預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響Fig. 2 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of phenylephrine precontracted vascular ring (n=8，

3.3 氫溴酸樟柳堿對PHE預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)的影響

氫溴酸樟柳堿可濃度依賴性地(1×10-4～5×10-3mmol·L-1)舒張PHE預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的血管環(huán)，結(jié)果顯示，內(nèi)皮完整血管環(huán)的EC50=5.61(3.88，8.10) mmol·L-1，Emax=47.93%±18.63%；去內(nèi)皮血管環(huán)的EC50=5.64(4.42， 7.20) mmol·L-1，Emax=46.72%±8.97%，與內(nèi)皮完整血管環(huán)的相比，舒張率無明顯變化(P>0.05)(圖3)。

圖3 氫溴酸樟柳堿對苯腎上腺素預(yù)收縮的內(nèi)皮完整(E+)和去內(nèi)皮(E-)血管環(huán)張力的影響Fig. 3 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of phenylephrine precontracted vascular ring with (E+) and without (E-) endothelium (n=8，

3.4 氫溴酸樟柳堿對L-NAME預(yù)孵血管環(huán)的影響

氫溴酸樟柳堿可濃度依賴地(1×10-4～5×10-3mmol·L-1)舒張L-NAME預(yù)孵血管環(huán)，結(jié)果顯示， Emax=42.44%±16.47%。用L-NAME預(yù)孵血管環(huán)后，氫溴酸樟柳堿對血管的舒張效果無明顯減弱(P>0.05)(圖4)。

圖4 氫溴酸樟柳堿對左旋硝基精氨酸甲酯預(yù)孵血管環(huán)張力的影響Fig. 4 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of Nω-nitro-L-arginine methyl ester precontracted

3.5 氫溴酸樟柳堿對鉀離子通道阻滯劑預(yù)孵血管環(huán)的影響

TEA、4-AP、Gly、BaCl2對氫溴酸樟柳堿舒張PHE預(yù)收縮血管環(huán)均無明顯作用，Emax分別為91.07%±19.94%(P>0.05)、45.60%±22.88%(P>0.05)、41.11%±8.69%(P>0.05)、41.52%±14.39%(P>0.05)(圖5)。

3.6 氫溴酸樟柳堿對血管環(huán)外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放的影響

在無Ca2+溶液中，2×10-3mol·L-1氫溴酸樟柳堿可以顯著增強(qiáng)PHE引起的血管短暫收縮，Emax由7.57%±5.99%增加至17.13%±5.58%(P<0.01)，增加了9.56%±9.09%。在此基礎(chǔ)上，加入CaCl2，血管環(huán)再次出現(xiàn)收縮，經(jīng)氫溴酸樟柳堿預(yù)孵的血管環(huán)與對照組的收縮率分別為33.13%±6.77%、38.37%±13.24%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

細(xì)胞外流入和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放是血管平滑肌收縮所需Ca2+的主要來源，包括經(jīng)受體操作性鈣通道(receptor operated calcium channel，ROC)和電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channel，VDC)的外鈣流入及主要來自肌漿網(wǎng)的內(nèi)鈣釋放(Hamadaetal.，1997；Carmignotoetal.，1998)。KCl誘導(dǎo)的血管收縮是通過細(xì)胞膜去極化激活VDC，而PHE則是與α1受體特異性結(jié)合激活ROC，外鈣內(nèi)流從而引起血管收縮(Kravtsov & Kwan，1995；Ratz & Berq，2006)。氫溴酸樟柳堿在體外1×10-4～5×10-3mol·L-1范圍內(nèi)能濃度依賴性舒張KCl和PHE誘導(dǎo)的頸總動脈環(huán)收縮，表明氫溴酸樟柳堿舒張血管與抑制ROC和VDC介導(dǎo)的外Ca2+內(nèi)流有關(guān)，氫溴酸樟柳堿對PHE預(yù)收縮的血管舒張作用強(qiáng)于KCl，且對KCl預(yù)收縮血管的作用具有低濃度收縮血管、高濃度舒張血管的雙向作用，這有待進(jìn)一步探索。

將離體大鼠頸總動脈環(huán)去除內(nèi)皮，或以L-NAME、KCa通道阻滯劑TEA、KV通道阻滯劑4-AP、KIR通道阻滯劑BaCl2和KATP通道抑制劑Gly預(yù)孵血管環(huán)，均對氫溴酸樟柳堿的舒張血管作用無顯著抑制作用，表明氫溴酸樟柳堿通過非內(nèi)皮依賴途徑舒張血管，且與NO及Kv、KCa、KIR、KATP通道無關(guān)。而在無鈣溶液中的結(jié)果提示，氫溴酸樟柳堿促進(jìn)血管收縮的機(jī)制可能與促進(jìn)肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+的釋放有關(guān)。對于PHE預(yù)收縮的去內(nèi)皮血管環(huán)，Emax無明顯變化，表明氫溴酸樟柳堿通過非內(nèi)皮依賴途徑舒張血管。L-NAME不能抑制氫溴酸樟柳堿對PHE誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮的舒張作用，表明NO沒有介導(dǎo)氫溴酸樟柳堿對血管環(huán)的舒張作用。鉀離子通道在維持血管張力方面有著重要的作用。本研究在KCl誘導(dǎo)的頸總動脈環(huán)收縮的基礎(chǔ)上，分別用TEA、4-AP、BaCl2和Gly預(yù)敷血管環(huán)，發(fā)現(xiàn)均對氫溴酸樟柳堿的血管舒張反應(yīng)無顯著抑制作用，表明氫溴酸樟柳堿的血管舒張作用與Kv、KCa、KIR、KATP通道無關(guān)。氫溴酸樟柳堿對血管環(huán)外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放的影響結(jié)果顯示，其促進(jìn)血管收縮的機(jī)制可能與促進(jìn)肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+的釋放有關(guān)。

氫溴酸樟柳堿是一種抗膽堿能藥，具有廣泛的藥理活性。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面，氫溴酸樟柳堿可改善雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎所致慢性腦缺血大鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷與凋亡，且其機(jī)制與減少P53蛋白表達(dá)有關(guān)(陳丹丹等，2018)；氫溴酸樟柳堿還可對抗線栓法所致的大鼠大腦中動脈阻塞腦缺血/再灌注損傷，降低模型動物病理學(xué)評分，提高存活神經(jīng)元數(shù)目，其機(jī)制與抗氧化損傷及提高p-Akt的表達(dá)有關(guān)(陳丹丹等，2017b)；在體外用氯化鈷處理腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，建立化學(xué)性缺氧模型，氫溴酸樟柳堿干預(yù)后可顯著提高細(xì)胞存活率，較好恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)，其機(jī)制與誘導(dǎo)低氧狀態(tài)細(xì)胞自噬有關(guān)(陳丹丹等，2017a)；氫溴酸樟柳堿還可調(diào)節(jié)正常大鼠腦組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝(匡培根等，1984)。除對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用外，氫溴酸樟柳堿也可改善血流變及微循環(huán)。氫溴酸樟柳堿可改善壞死性胰腺炎模型犬的血液流變性(嚴(yán)律南等，1990)，改善急性腎功能衰竭大鼠的腎動脈血管功能，保護(hù)腎微血管損傷(吳廣禮等，2002)，擴(kuò)張大鼠腸系膜微動脈管徑(劉萍等，1999)。氫溴酸樟柳堿與普魯卡因的復(fù)方制劑——復(fù)方樟柳堿被廣泛應(yīng)用于眼科，可改善眼缺血和保護(hù)視神經(jīng)，在臨床上可用于治療視網(wǎng)膜病變、缺血性視神經(jīng)及脈絡(luò)膜病變等(彭娟等，2007)。

氫溴酸樟柳堿的藥理作用雖然廣泛，但關(guān)于其對血管作用的研究卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究氫溴酸樟柳堿對離體大鼠頸總動脈環(huán)的作用，初步明確氫溴酸樟柳堿能夠濃度依賴性地舒張大鼠頸總動脈環(huán)，且對KCl預(yù)收縮的大鼠頸總動脈血管環(huán)具有小劑量收縮、大劑量舒張的雙向作用，與其對血管具有雙向作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)道(陳錦明等，1983)相符。本課題組在后續(xù)還將繼續(xù)就氫溴酸樟柳堿對微循環(huán)的影響做進(jìn)一步研究。

綜上所述，氫溴酸樟柳堿能夠濃度依賴性地舒張大鼠頸總動脈環(huán)，且其機(jī)制與非內(nèi)皮依賴途徑及促肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放相關(guān)。