鄭佩華， 汪蕾， 張秀霞， 王冬梅， 李軍濤， 魯耀鵬， 冼健安*， 王安利

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室，?？?71101； 2.華南師范大學腦科學與康復(fù)醫(yī)學研究院，廣州510631； 3. 華南師范大學生命科學學院，廣州510631)

凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei俗稱南美白對蝦，由于具有生長速度快、抗逆性強、肉質(zhì)鮮美、經(jīng)濟價值高等特點，成為目前世界上養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量最高的三大對蝦養(yǎng)殖品種之一。近年來，隨著蝦類養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高，養(yǎng)殖環(huán)境的日趨惡化，蝦類疾病的危害日趨嚴重，養(yǎng)成率低下、經(jīng)濟損失嚴重。蝦類抗脅迫和抗病的免疫防御機制是解決上述問題的理論基礎(chǔ)，也是一直以來的研究重點。

細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)酶系是一類結(jié)構(gòu)上含有血紅素和硫羥基，功能上參與生物體代謝途徑、調(diào)節(jié)外源物質(zhì)和內(nèi)源物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化的末端氧化酶，廣泛存在于不同生物體的各種細胞和組織中(李術(shù)等，2013；梁艷等，2014)。CYP在細胞內(nèi)的毒素、環(huán)境污染物、致癌物質(zhì)及藥物等代謝方面均發(fā)揮重要作用(冷欣夫，邱星輝，2001；Parmentieretal.，2005)。目前，關(guān)于昆蟲CYP的研究已較深入，尤其是CYP對昆蟲殺蟲劑抗藥性的影響(邱星輝，冷欣夫，1999)，以及CYP參與保幼激素、蛻皮激素等內(nèi)源性化合物的合成與代謝(艾均文，2008)。關(guān)于甲殼動物CYP的研究較少，在龍蝦Homarusamericanus(Snyderetal.，1998)、溝蝦Orconectslimosus(Dauphinetal.，1999)、岸蟹Carcinusmaenas(Rewitzetal.，2003)和凡納濱對蝦(夏西超等，2012)中有CYP4家族的研究報道，該家族可能主要與蛻皮激素的代謝有關(guān)；淡水枝角水蚤Daphniapulex的CYP被劃分為4個家族：線粒體型、CYP2、CYP3和CYP4，其中，CYP2家族中的CYP370家系基因數(shù)量較多，占CYP基因總量的20%，CYP370家系的具體功能仍不清楚，推測淡水枝角水蚤擁有較大量的CYP370家系基因，可能與CYP370家系參與環(huán)境脅迫響應(yīng)有關(guān)，這些脅迫因子包括水體中各類毒性污染物以及類似植物生物堿毒素的生長和行為的刺激物等(Baldwinetal.，2009)。

本研究在凡納濱對蝦氨氮脅迫轉(zhuǎn)錄組的差異表達基因中發(fā)現(xiàn)了1個CYP基因，通過cDNA末端快速克隆(RACE)技術(shù)克隆得到全長cDNA序列，經(jīng)國際細胞色素P450命名委員會進行序列比對，該基因?qū)儆贑YP370家系，命名為CYP370C2。本研究對CYP370C2基因進行了序列分析和組織特異性表達量分析，并測定了其在氨氮脅迫作用下以及脂多糖(LPS)刺激下的表達響應(yīng)，探討其在抗脅迫和抗病原體免疫防御中的作用，為進一步研究提高對蝦的抗脅迫和抗病能力提供研究基礎(chǔ)，同時也拓展了凡納濱對蝦的基因資源庫，為對蝦基因資源的利用提供了基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 實驗對蝦

凡納濱對蝦于2017年6月購自海南省?？谑心仇B(yǎng)殖場，選取500尾生長狀態(tài)良好的個體，雌雄隨機分配，平均體質(zhì)量11.8 g±1.7 g。在實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)，水溫24 ℃±2 ℃，鹽度18‰，pH7.9～8.0，不間斷曝氣，并循環(huán)過濾。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取1尾凡納濱對蝦肝胰腺放入液氮中研磨，按照Trizol法提取總RNA，用微量分光光度計NanoDrop 2000(NanoDrop Technologies，USA)檢驗所提取的總RNA純度并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗其完整性，用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa，大連)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 中間片段序列克隆

從凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中得到CYP370C2基因的初步cDNA序列，根據(jù)此序列設(shè)計中間片段引物CYP370-F1和CYP370-R1(表1)。以凡納濱對蝦的肝胰腺cDNA為模板進行第一輪PCR擴增，程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。PCR產(chǎn)物使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]進行純化，再連接至pMD18-T載體(TaKaRa，大連)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞(TaKaRa，大連)，培養(yǎng)并挑選陽性克隆送至華大基因公司測序。

1.4 5’和3’末端序列克隆

cDNA 3’末端克隆按照3’-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase試劑盒(TaKaRa，大連)進行操作，設(shè)計基因特異性引物CYP370-3’F1和3’RACE Outer Primer進行PCR擴增，程序如下：94 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

cDNA 5’末端克隆按照SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech，USA)進行操作，使用特異性引物CYP370-5’R1和universal primer mix(UPM)進行PCR擴增，程序如下：94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)。獲得5’-和3’-RACE PCR產(chǎn)物后進行凝膠純化、連接載體、轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞并測序。將獲得的中間片段序列、3’末端序列和5’末端序列進行拼接，獲得序列全長。

1.5 生物信息學分析

使用DNAStar中的EdiSeq程序推導開放閱讀框序列；利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)對基因的核酸序列和氨基酸序列進行同源性分析；用SignalP 3.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)預(yù)測信號肽。蛋白理化性質(zhì)預(yù)測使用的是Expasy(http：//au.expasy.org/tools/)。運用Clustal X對氨基酸序列進行多序列比對，再使用MEGA 6.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并用Bootstrap重復(fù)1 000次計算各分支的置信度。

1.6 氨氮脅迫和LPS注射實驗

1.6.1氨氮脅迫實驗選取健康的凡納濱對蝦隨機分為對照組和氨氮脅迫組，每組3個平行，每個平行25尾。脅迫組中的水體氨氮濃度設(shè)置為20 mg·L-1(實測值為19.9 mg·L-1±0.8 mg·L-1)(Liu & Chen，2004)，對照組不添加氨氮(氨氮未檢出)，其他實驗條件與暫養(yǎng)期間一致。脅迫實驗共進行48 h，實驗期間每24 h換水1次，每次換水量為總水量的1/3，以保證相應(yīng)的水體氨氮濃度。在氨氮脅迫后的0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h取樣，每個時間點對照組和氨氮脅迫組各隨機采集9尾，取肝胰腺和鰓立即在液氮中速凍，然后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2LPS注射實驗將LPS(2 mg·mL-1，E.coliL2880，Sigma)溶解于生理鹽水(0.8%NaCl)中，配制成終濃度為2 μg·μL-1的LPS工作液。將健康對蝦隨機分成對照組和LPS注射組，每組3個平行，每個平行25尾。LPS注射組每尾注射LPS工作液5 μL(Xianetal.，2016，2017)，對照組注射等量的無菌生理鹽水。在LPS注射后的0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h取樣，每個時間點對照組和LPS注射組各隨機采集9尾，取肝胰腺和鰓立即在液氮中速凍，然后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 相對表達量分析

根據(jù)測得的凡納濱對蝦CYP370C2基因的cDNA序列設(shè)計熒光定量引物CYP370-RT-F1和CYP370-RT-R1，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列為β-actinF和β-actinR(表1)。實時熒光定量PCR的反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。實驗儀器為美國Agilent公司的Stratagene Mx 3005P，實驗結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.8 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(Mean±SD)。組織表達量數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)；氨氮脅迫和LPS注射實驗的數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0進行t檢驗分析。

表1 本研究所用引物匯總Table 1 Summary of primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 CYP370C2基因cDNA序列分析

凡納濱對蝦CYP370C2基因的cDNA序列如圖1所示，全長1 745 bp，包含1個1 464 bp的開放閱讀框，編碼由487個氨基酸構(gòu)成的多肽，預(yù)測理論等電點為7.24，分子量為55.06 kDa。5’和3’非編碼區(qū)分別為139 bp和142 bp，3’末端有1個終止密碼子(TAA)、1個多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA)和1個poly A尾。氨基酸序列中包括CYP蛋白特有的血紅素結(jié)合區(qū)FxxGxRxCxG(FGKGRRLCLG)、Ⅰ螺旋保守區(qū)AGxxT(AGAET)、C螺旋保守區(qū)WxxxR(WKEQR)和K螺旋保守區(qū)ExxR、PxRF(EIFR、PERF)。氨基酸序列信號肽分析顯示，N端氨基酸2～21為信號肽，是一種分泌蛋白。

2.2 CYP370C2基因序列同源性及進化樹分析

運用BLAST分析得到，凡納濱對蝦CYP370C2基因序列與三疣梭子蟹PortunustrituberculatusCYP基因(GenBank登錄號：AJF94637.1)序列相似度最高，為64%；與甲殼綱Crustacea的淡水枝角水蚤(GenBank登錄號：EFX83696.1)、昆蟲綱Insecta的濕木白蟻Zootermopsisnevadensis(GenBank登錄號：KDR19530.1)、內(nèi)口綱Entognatha的跳蟲Orchesellacincta(GenBank登錄號：ODM99561.1)的相似度次之，為43%；與昆蟲綱的臺灣乳白蟻Coptotermesformosanus(GenBank登錄號：AGQ48062.1)、甲殼綱的大型蚤Daphniamagna(GenBank登錄號：KZS13729.1)和太平洋折翅蠊Diplopterapunctata(GenBank登錄號：AAS13464.1)的分別為41%、40%和39%。

與凡納濱對蝦CYP370C2基因和序列相似性最高的均屬于節(jié)肢動物門Arthropoda的7個物種的CYP基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，這些CYP基因在系統(tǒng)進化樹上分為2個分支。凡納濱對蝦首先與軟甲綱Malacostraca的三疣梭子蟹聚為一支，該分支與甲殼綱的淡水枝角水蚤和大型蚤聚為小分支，昆蟲綱等翅目Isoptera的物種聚為一支，然后與膜翅目Hymenoptera聚為小分支(圖2)。

2.3 CYP370C2基因在不同組織中的相對表達量

CYP370C2基因在凡納濱對蝦的肌肉、腸道、鰓、血細胞、肝胰腺、心臟和眼柄等7個組織中均有表達，在肝胰腺中的相對表達量最高，顯著高于其他組織(P<0.05)，其次是鰓、腸道、血細胞、心臟和眼柄，在肌肉中的相對表達量最低(圖3)。

2.4 氨氮脅迫對CYP370C2基因相對表達量的影響

在48 h的氨氮脅迫試驗中，凡納濱對蝦肝胰腺中CYP370C2基因相對表達量在脅迫的24 h和48 h顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)，在48 h時達到峰值，約為對照組的3.26倍；鰓中CYP370C2基因相對表達量在脅迫的12～48 h顯著上升(12 h：P<0.05， 24 h：P<0.01， 48 h：P<0.001)，在24 h時達到最高值，為對照組的16.67倍(圖4)。

2.5 LPS注射對CYP370C2基因相對表達量的影響

凡納濱對蝦肝胰腺中的CYP370C2基因相對表達量在LPS注射后的3～48 h均顯著上調(diào)(P<0.05)，最大值出現(xiàn)在注射后的12 h，約為對照組的11.29倍；鰓中CYP370C2基因相對表達量在注射后的3 h和6 h呈現(xiàn)顯著的下降(P<0.05，P<0.01)，在12 h恢復(fù)至對照組水平，在24 h和48 h急劇上調(diào)，24 h達到最大值，約為對照組的4.16倍(圖5)。

圖1 凡納濱對蝦CYP370C2基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences ofCYP370C2 gene ofLitopenaeusvannamei

起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)用方框表示， 多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA)用下劃線表示， P450蛋白特有的血紅素結(jié)合區(qū)(FGKGRRLCLG)、 Ⅰ螺旋保守區(qū)(AGAET)、 C螺旋保守區(qū)(WKEQR)和K螺旋保守區(qū)(EIFR、PERF)用灰色陰影顯示

The letters in box indicate the start codon (ATG) and the stop codon (TAA)， the region underlined indicates the polyadenylation signal sequence (AATAAA)， the areas shaded in gray indicate heme-binding domain (FGKGRRLCLG)， Ⅰ-helix (AGAET)， C-helix(WKEQR) and K-helix(EIFR， PERF)

圖2 使用鄰接法對凡納濱對蝦CYP370C2基因的系統(tǒng)進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of Litopenaeus vannamei CYP370C2 gene by using neighbor-joining method

圖3 CYP370C2基因在凡納濱對蝦不同組織中的相對表達量Fig. 3 Relative expression levels of CYP370C2 gene in different tissues of Litopenaeus vannamei

不同小寫字母表示不同組織之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

Different lowercase letters show there is a significant difference between different tissues (P<0.05)

圖4 氨氮脅迫對凡納濱對蝦肝胰腺(A)和鰓(B)中CYP370C2基因相對表達量的影響Fig. 4 Effects of ammonia-N stress on the relative expression levels of CYP370C2 gene in hepatopancrea (A) and gill (B) of Litopenaeus vannamei

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 下同the same below

圖5 脂多糖(LPS)注射對凡納濱對蝦肝胰腺(A)和鰓(B)中CYP370C2基因相對表達量的影響Fig. 5 Effects of lipopolysaccharide (LPS) injection on the relative expression levels of CYP370C2 gene in hepatopancrea (A) and gill (B) of Litopenaeus vannamei

3 討論

3.1 凡納濱對蝦CYP370C2基因生物信息學分析與組織表達特異性

本研究克隆的凡納濱對蝦CYP基因?qū)儆贑YP2家族中的CYP370家系，命名為CYP370C2，經(jīng)比對，其序列與節(jié)肢動物門其他物種相似。凡納濱對蝦CYP370C2基因與夏西超等(2012)克隆得到的CYP4V18基因的一致性只有18.36%，2個基因序列的較大差異表明它們的蛋白可能擁有不同的生理功能。幾種節(jié)肢動物的CYP370C2基因系統(tǒng)發(fā)育樹表明，CYP370C2基因的聚類關(guān)系符合物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

CYP在各種組織和器官中廣泛存在，但其分布具有組織特異性。在魚類研究中發(fā)現(xiàn)，CYP在肝胰臟中分布最多，在鰓、腎臟、心臟等組織中少量存在(Britteboetal.，1994；王芳等，2006；胡曉等，2011)，這與本研究的結(jié)果較一致。肝胰腺是外源有毒物質(zhì)代謝的主要場所，通過CYP的氧化反應(yīng)以及谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)，使外源物質(zhì)活性降低、水溶性增加，從而經(jīng)腎臟等排出體外(Benetetal.，1996)。鰓是水生動物的呼吸器官，由于鰓與外界水環(huán)境直接接觸，與其他組織器官相比，鰓更容易受到病原體的侵染以及水體污染物的毒害。CYP370C2基因在肝胰腺和鰓中的高表達量表明，它在這3個重要器官的防御機制中發(fā)揮重要作用。

3.2 凡納濱對蝦CYP370C2基因?qū)Π钡{迫的表達響應(yīng)

養(yǎng)殖水體中的氨氮主要來源于水生動物含氮廢物的排泄和食物分解，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的水污染物之一(孫國銘等，2002；姜令緒等，2004；冼健安等，2014)。以往的研究表明，氨氮對水生動物包括甲殼綱十足目Decapoda動物具有較強的毒性。氨氮會抑制對蝦的生長和變態(tài)，損壞其組織和器官，影響其免疫與代謝功能，降低其對環(huán)境的適應(yīng)力、耐受力及對疾病的抵抗能力，造成對蝦發(fā)病死亡(冼健安等，2014)。本實驗中，在氨氮脅迫后期，對蝦肝胰腺和鰓中CYP370C2基因的表達量均呈現(xiàn)顯著上調(diào)，表明CYP370C2基因可能在抗氨氮脅迫的防御機制中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于甲殼動物CYP370家系的研究僅見于淡水枝角水蚤，該研究發(fā)現(xiàn)，相對于昆蟲的CYP基因，淡水枝角水蚤CYP370家系基因數(shù)量得到了擴充，約占其CYP基因總量的20%。目前關(guān)于CYP370家系的研究仍甚少，推測CYP370家系基因數(shù)量的擴充可能與其在對抗環(huán)境脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用(Baldwinetal.，2009)。據(jù)本研究結(jié)果，推測凡納濱對蝦CYP370C2基因可能參與了氨氮脅迫下毒性代謝物的代謝過程，將氨氮脅迫所引起的有毒有害代謝物進行分解，以解除毒性并利于代謝廢物排出體外，從而降低氨氮脅迫帶來的損害。

比較肝胰腺和鰓，CYP370C2基因在敏感度和表達水平上均有一定的差異。鰓中CYP370C2基因相對表達量在脅迫的12 h開始顯著上調(diào)，肝胰腺中CYP370C2基因相對表達量在24 h開始出現(xiàn)顯著上升，表明鰓中CYP370C2基因?qū)Π钡{迫響應(yīng)的敏感度高于肝胰腺。另一方面，氨氮脅迫下，鰓中CYP370C2基因相對表達量比肝胰腺高，最高值達到了對照組的16.67倍，而在肝胰腺中，最高值僅為對照組的3.26倍。鰓是對蝦直接與外部環(huán)境接觸的器官，水環(huán)境中的氨會通過鰓上皮細胞進入血淋巴，再被運輸至其他部位，鰓是首先受到氨氮持續(xù)性毒害作用的組織器官，這可能是鰓中CYP370C2基因?qū)Π钡{迫具有更高敏感度和更強烈表達響應(yīng)的原因，機體通過上調(diào)鰓中CYP370C2基因的表達量，起到對鰓的抗脅迫保護作用。肝胰腺是發(fā)揮解毒作用的器官，研究顯示在氨氮脅迫作用下，氨氮主要積累在對蝦的肝胰腺中(Chen & Chen，2000)，可能是蝦體將氨氮運輸至肝胰腺進行解毒代謝。本研究結(jié)果顯示，肝胰腺中CYP370C2基因的基礎(chǔ)表達量遠高于其他組織，在氨氮脅迫作用下，其表達量也被進一步誘導上調(diào)，表明CYP370C2基因可能參與了氨氮脅迫下肝胰腺的解毒代謝過程。

3.3 凡納濱對蝦CYP370C2基因?qū)PS刺激的表達響應(yīng)

LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁組分之一，具有高度抗原性和細胞毒性，也被稱為內(nèi)毒素。研究顯示LPS可誘導活性氧(ROS)引起的Ca2+介導的血細胞凋亡，導致血細胞數(shù)量下降，同時也會引起血細胞脫顆粒釋放酚氧化酶原系統(tǒng)等一系列的免疫響應(yīng)(Xianetal.，2016，2017)。經(jīng)LPS刺激后，對蝦許多與免疫相關(guān)的基因在鰓或肝胰腺中都有不同程度的上調(diào)，例如，與Toll樣受體(TLR)-NF-kB途徑相關(guān)的Sp?tzle基因、NOS、溶菌酶等(Yaoetal.，2010；Peregrino-Uriarteetal.，2012；Yuanetal.，2017)，表明這些免疫相關(guān)基因參與了抗菌防御過程。在本研究中，LPS對凡納濱對蝦肝胰腺和鰓中的CYP370C2基因表達量也產(chǎn)生了顯著影響。CYP370C2基因?qū)PS刺激的表達響應(yīng)在肝胰腺和鰓中存在一定差異。經(jīng)LPS刺激后，在肝胰腺中，CYP370C2基因的相對表達量在48 h內(nèi)一直呈現(xiàn)上調(diào)的狀態(tài)；而在鰓中，CYP370C2基因的轉(zhuǎn)錄先被抑制，然后恢復(fù)，在后期再升高。該基因在不同器官間可能存在不同的調(diào)控機制，肝胰腺作為蝦類重要的免疫和解毒器官，其中，CYP370C2基因的表達迅速被LPS刺激所誘導上調(diào)并持續(xù)保持高表達，表明CYP370C2基因可能作為重要的解毒酶參與了肝胰腺抗LPS毒性的防御過程。另一方面，CYP370C2基因在2個組織中的表達強度也存在差異。經(jīng)LPS刺激后，CYP370C2基因在肝胰腺中的最高表達量可達對照組的11.29倍，而在鰓中的相對表達量約為對照組的4.16倍，肝胰腺表現(xiàn)出更為強烈的表達響應(yīng)，這一結(jié)果與氨氮脅迫的結(jié)果相反，這可能與環(huán)境脅迫和病原體侵染過程的差異有關(guān)。