干旱脅迫下平邑甜茶葉片差異表達(dá)蛋白分析

楊小妮，王俊花，楊劍鋒，祁香寧，段宇敏，韓明玉，張林森

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

干旱是影響全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最普遍的一種環(huán)境脅迫[1]，其會加速植物葉片衰老，減少作物產(chǎn)量，降低經(jīng)濟(jì)效益[2]。植物在長期進(jìn)化過程中為了適應(yīng)干旱脅迫形成了一套防御機(jī)制，當(dāng)受到干旱脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會發(fā)生生理生化反應(yīng)以響應(yīng)脅迫。在干旱脅迫下，植物感受系統(tǒng)在感受到化學(xué)信號后會將信號進(jìn)一步傳遞給轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因表達(dá)(調(diào)節(jié)基因)，利用高通量方法可識別關(guān)鍵調(diào)控過程的步驟和基因[3-5]。然而，越來越多的證據(jù)表明，由于蛋白質(zhì)豐度調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，轉(zhuǎn)錄組通常與蛋白質(zhì)組表現(xiàn)不一致[6]，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄后調(diào)控會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄與其同源蛋白相關(guān)性變差[7]。由于蛋白質(zhì)組分析可提供數(shù)百到數(shù)千蛋白質(zhì)的綜合定性和定量信息，因此它成為研究各種生物過程的重要工具，不僅可以補(bǔ)充轉(zhuǎn)錄組調(diào)查，還能更直接地了解與特定試驗(yàn)條件相關(guān)的代謝過程[8]。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)被證明是探索生物化學(xué)途徑和植物對各種非生物脅迫的復(fù)雜響應(yīng)機(jī)制的有力工具[9]。

西北黃土高原是世界上蘋果連片種植面積最大的區(qū)域，其蘋果栽種面積居我國第一，為8.193萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)700.32萬t，面積和產(chǎn)量分別占全國的39%和35%[10]。但是該地區(qū)降雨少而蒸發(fā)強(qiáng)，水資源虧缺嚴(yán)重限制了蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為適應(yīng)干旱環(huán)境，生產(chǎn)中一般采用抗性砧木嫁接繁殖，平邑甜茶即是常用的一種重要砧木，其具有無融合生產(chǎn)特性，苗木生長高度一致，非常適合用于逆境處理研究。目前對果樹的抗旱研究主要集中在生理生化方面[11-12]，而關(guān)于果樹在干旱脅迫下的分子機(jī)理，尤其是在蛋白組水平反應(yīng)變化的研究鮮見報(bào)道。所以，本研究采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量方法(iTRAQ-based)，評估蘋果砧木在干旱脅迫下的蛋白質(zhì)應(yīng)激反應(yīng)，分析差異蛋白及其參與的生化途徑，以理解蘋果砧木應(yīng)答干旱脅迫的分子調(diào)控機(jī)制，為今后蘋果砧木的抗旱分子改良提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

2016年3月從西北農(nóng)林科技大學(xué)國家蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系示范苗圃基地(34°20′N，108°24′E)，挑選生長勢基本一致的2年生健康平邑甜茶(Malushupehensis)砧木平茬，移栽到直徑25 cm、高30 cm的盆中，將土、沙和基質(zhì)按質(zhì)量比3∶1∶1拌勻，每盆裝12 kg。每個(gè)盆用黑色塑料膜和反光膜包裹以避免土壤蒸發(fā)和溫度過高的影響。置于防雨棚中培養(yǎng)。試驗(yàn)前給予標(biāo)準(zhǔn)的園藝病蟲害管理。

同年8月份，隨機(jī)選取長勢一致的平邑甜茶盆栽苗，設(shè)置2個(gè)水分處理(對照Mh-CK和逐漸干旱Mh-GD)，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)。試驗(yàn)前即2016-08-02之前每天充分灌溉所有試驗(yàn)材料，開始試驗(yàn)后，Mh-GD處理不再澆水，一直保持干旱；Mh-CK處理通過每天稱重，補(bǔ)充灌溉其蒸散量，始終保持土壤濕潤。13 d后，Mh-GD處理植株葉片出現(xiàn)萎蔫情況時(shí)采樣。輕輕擦洗干凈植株頂部葉片，采集后迅速用錫箔紙包好放進(jìn)液氮速凍，帶回存入超低溫冰箱備用。

1.2 土壤水勢、黎明前葉水勢、葉片相對含水量及光合作用的測定

2016-07-28，將連接在CR1000數(shù)據(jù)采集器(Campbell Scientific Inc，USA)上的4個(gè)MPS-6土壤水勢傳感器(Decagon，USA)，分別埋入2株平邑甜茶Mh-CK處理和2株Mh-GD處理盆栽苗土中，每0.5 h自動采集1次數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測土壤水勢的變化，從而抓住植株失水臨界點(diǎn)，然后用Campbell公司提供的Loggernet 4.0軟件輸出數(shù)據(jù)，由于埋入的傳感器需要土壤沉降才能準(zhǔn)確讀數(shù)，故開始記錄數(shù)據(jù)的日期為2016-08-02。

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤水勢低于-700 kPa時(shí)葉片會出現(xiàn)輕微萎蔫現(xiàn)象。試驗(yàn)開始第13天，天氣晴朗，Mh-GD處理的土壤水勢達(dá)到-753.9 kPa，葉片出現(xiàn)了萎蔫現(xiàn)象。當(dāng)天06：00左右，用壓力室(MODEL-1000，PMS Instrument，Corvallis，OH，USA)測定黎明前葉水勢(ψleaf)。同天上午09:00-11:00，每株平邑甜茶選取相同部位的4片功能葉片，用便攜式光合儀(Ciras-2，PPS，England)測定不同處理植株的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)等光合作用指標(biāo)。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集不同處理平邑甜茶葉片，每株6片，測定葉片相對含水量(RWC)。

RWC=(FM-DM)/(TM-DM)×100%。

式中：FM、DM和TM分別表示葉片鮮質(zhì)量、干質(zhì)量及飽和水下葉片質(zhì)量。

1.3 葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線參數(shù)的測定

干旱脅迫第11天，即2016-08-12，在晴朗的上午09:00-10:00，從不同處理的每株平邑甜茶上選擇5片成熟葉片，利用便攜式葉綠素?zé)晒鈨x(PPEA，Hansatech instruments LTD，king’s Lynn，Norfolk，UK)測定其葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線(OJIP)相關(guān)參數(shù)，即單位反應(yīng)中心吸收光能(ABS/RC)、性能指標(biāo)(PI)、PSⅡ潛在活性(Fv/F0)和PSⅡ最大光合效率(Fv/Fm)。測量前用暗適應(yīng)夾子使葉片暗適應(yīng)至少20 min，采用3 500 μmol/(m2·s)的飽和光誘導(dǎo)OJIP曲線，熒光信號記錄10 μs開始，3 s結(jié)束。用PEA Plus軟件(Hansatech instruments for Handy PEA & Pocket PEA ChlorophyⅡ Fluorimeters)傳輸數(shù)據(jù)導(dǎo)出熒光參數(shù)。

1.4 葉片蛋白質(zhì)的iTRAQ標(biāo)記

2個(gè)處理的平邑甜茶葉片蛋白質(zhì)采用丙酮沉淀法提取。蛋白質(zhì)經(jīng)過還原，封閉胰蛋白酶酶切后，用iTRAQ 113/114 和iTRAQ 115/116分別標(biāo)記Mh-CK、Mh-GD處理的葉片蛋白，建成兩個(gè)比對組(113/114，115/116)。采用考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)iTRAQ試劑盒的操作步驟進(jìn)行蛋白還原烷基化、酶解及標(biāo)記。應(yīng)用強(qiáng)陽離子交換色譜方法對混合后的肽段進(jìn)行HPLC分離，然后再進(jìn)行反向色譜-Triple TOF 檢測和分析。采用 Protein Pilot Software V.5.0(SCIEX，SA)軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)庫來源于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(Uniprot 蛋白庫)，篩選出標(biāo)準(zhǔn)為FDR<1%、Unused>1.3、肽段數(shù)(peptides (95%))≥1的可信蛋白。

1.5 差異表達(dá)蛋白的篩選

以可信蛋白篩選結(jié)果為基礎(chǔ)篩選差異表達(dá)蛋白，本試驗(yàn)的挑選標(biāo)準(zhǔn)是將差異倍數(shù)>1.5(上調(diào))或<0.67(下調(diào))，且P<0.05的蛋白作為顯著差異表達(dá)蛋白。

1.6 差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析

篩選出可信蛋白和差異表達(dá)蛋白后，根據(jù)差異表達(dá)蛋白的ID及其在各組處理間的差異倍數(shù)(Fold change)進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。即應(yīng)用基因本體(GeneOntology, GO)數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)計(jì)算每個(gè)term的差異蛋白數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，與整個(gè)蛋白質(zhì)背景相比，找出在差異表達(dá)蛋白中顯著富集的GO條目。差異表達(dá)蛋白的Pathway顯著分析同GO功能顯著富集分析相近，以差異表達(dá)蛋白在京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)Pathway為單位，運(yùn)用超幾何檢驗(yàn)，與整個(gè)蛋白質(zhì)的背景相比來確定差異表達(dá)蛋白主要富集的Pathway。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對平邑甜茶土壤水勢、黎明前葉水勢的影響

由圖1可見，隨著時(shí)間推移，平邑甜茶Mh-CK處理的土壤水勢一直保持在-35.0 kPa內(nèi)。而Mh-GD處理的土壤水勢逐漸下降，且下降速率由小變大，第13天土壤水勢由最初的-10.4 kPa下降到-753.9 kPa，故在當(dāng)天采樣。干旱第13天即2016-08-14，平邑甜茶Mh-GD處理植株葉片出現(xiàn)了萎蔫現(xiàn)象，其黎明前葉水勢(ψleaf)顯著低于Mh-CK處理。

柱上標(biāo)不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同
Different lowercase letters show significant difference between treatments (P<0.05).The same below
圖1 不同處理下土壤水勢(A)和平邑甜茶黎明前葉水勢(ψleaf)(B)的變化
Fig.1 Soil moisture potential (A) and change of predawn leaf potential (B) ofMalushupehensisunder different treatments

2.2 干旱脅迫對平邑甜茶光合作用和葉片相對含水量的影響

由圖2可見，Mh-CK處理平邑甜茶的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)、葉片相對含水量(RWC)均顯著高于Mh-GD處理，分別高出130%，170%，360%，13%，說明在干旱脅迫下， Mh-GD處理平邑甜茶通過降低葉片含水量、Pn、Gs及Tr來抵御脅迫。

圖2 干旱脅迫對平邑甜茶光合作用及葉片相對含水量的影響
Fig.2 Effect of drought treatments on photosynthesis and leaf relative water content ofMalushupehensis

2.3 干旱脅迫對平邑甜茶葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖3可以看出，在干旱脅迫下Mh-GD處理平邑甜茶植株的葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線高于Mh-CK處理。Mh-CK處理植株的單位反應(yīng)中心吸收光能(ABS/RC)、性能指標(biāo)(PI)、PSⅡ潛在活性(Fv/F0)和PSⅡ最大光合效率(Fv/Fm)分別高出Mh-GD處理80%，129%，10%，2%。Mh-GD處理的Fv/F0下降，表明PSⅡ活性中心受干旱脅迫的影響，光合原初反應(yīng)過程受阻。PI反應(yīng)可決定潛在光合作用能力，如反應(yīng)中心密度、用于電荷分離過程的光子吸收率和電子傳遞速率，干旱脅迫后PI顯著下降，說明Mh-GD處理葉片的光能轉(zhuǎn)換效率、電子傳遞速率、光能吸收率均下降。

圖3 干旱脅迫對平邑甜茶葉片熒光動力學(xué)曲線(A)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)(B)的影響
Fig.3 Effect of gradual drought treatments on chlorophyll fluorescence intensity curve (A) and chlorophyll fluorescence parameters (B) ofMalushupehensis

2.4 干旱脅迫下平邑甜茶的蛋白水平變化

利用iTRAQ技術(shù)，對Mh-CK、Mh-GD處理平邑甜茶葉片組織蛋白進(jìn)行相對定量與定量技術(shù)分析，共鑒定到1 897個(gè)蛋白。經(jīng)過進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)，有181個(gè)共同表達(dá)的顯著差異蛋白，其中上調(diào)蛋白81個(gè)(P<0.05，差異倍數(shù)>1.5)，下調(diào)蛋白100個(gè)(P<0.05，差異倍數(shù)<0.67)。

2.5 平邑甜茶差異表達(dá)蛋白的GO富集分析

對平邑甜茶差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO 顯著性分析，確定其行使的主要生物學(xué)功能，結(jié)果見表1。由表1可見，在生物學(xué)過程中，差異表達(dá)蛋白主要參與代謝過程、生物合成過程。作為細(xì)胞組分的蛋白質(zhì)主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，而與分子功能相關(guān)的蛋白主要是“結(jié)合”蛋白和“催化”蛋白(酶)。

表1 不同處理平邑甜茶差異表達(dá)蛋白的GO顯著富集分析Table 1 Significant enrichment GO analysis of differentially expressed proteins (DEPs) of Malus hupehensis

2.6 平邑甜茶差異表達(dá)蛋白的Pathway富集分析

為了解差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能，對平邑甜茶表達(dá)差異顯著的蛋白進(jìn)行了Pathway分析。結(jié)果(表2)顯示，已知的差異表達(dá)蛋白顯著富集的Pathway通路(P<0.05)集中在碳代謝(16個(gè)蛋白，占9%)、光合作用(6個(gè)蛋白，占3%)、代謝途徑(17個(gè)蛋白，占9%)等方面，有56%(101個(gè)蛋白)的差異表達(dá)蛋白是未知的。

2.7 干旱脅迫下平邑甜茶差異表達(dá)蛋白的功能

在干旱脅迫響應(yīng)中，平邑甜茶葉片差異表達(dá)蛋白參與了不同的生物學(xué)過程，顯著差異表達(dá)蛋白共181個(gè)，其中95個(gè)(占52%)蛋白功能未知，已知的86個(gè)差異表達(dá)蛋白功能可歸為10類(表3)。包括蛋白質(zhì)代謝(25個(gè)蛋白，占13.8%)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(11個(gè)蛋白，占6.1%)、碳代謝(10個(gè)蛋白，占5.5%)、細(xì)胞加工(10個(gè)蛋白，占5.5%)、能量代謝(5個(gè)蛋白，占2.8%)、光合途徑(6個(gè)蛋白，占3.3%)、金屬離子結(jié)合(4個(gè)蛋白，占2.2%)、抗逆反應(yīng)(8個(gè)蛋白，占4.4%)和其他(7個(gè)蛋白，占3.9%)(表3和表4)。

表3 干旱脅迫平邑甜茶顯著差異表達(dá)蛋白(P<0.05和變化倍數(shù)≥2.0)Table 3 Significant differentially expressed proteins under of Malus hupehensis drought treatments (P<0.05 and fold change≥2.0)

表3(續(xù)) Continued table 3

表3(續(xù)) Continued table 3

表4 干旱脅迫平邑甜茶差異表達(dá)蛋白的功能分類Table 4 Functional classification of differentially expressed proteins under drought treatments

3 討論與結(jié)論

3.1 干旱脅迫下平邑甜茶植株的生理指標(biāo)響應(yīng)

隨著土壤干旱脅迫的進(jìn)行，Mh-CK處理平邑甜茶的ψleaf、光合作用參數(shù)及RWC均顯著高于Mh-GD處理。多年來，人們都將黎明前葉水勢(ψleaf)作為衡量土壤水分狀態(tài)的直接指標(biāo)。前人在蘋果[13]和橡樹[14]上的研究結(jié)果顯示，干旱脅迫下ψleaf明顯下降。Kautz等[15]研究結(jié)果表明，干旱脅迫會引起RWC、葉綠素含量、Pn下降，葉片厚度變薄，脯氨酸含量升高。這些變化均是對干旱脅迫的響應(yīng)。

植株正常生理狀態(tài)下，多數(shù)高等植物的Fv/Fm處于0.8～0.85，低于這個(gè)范圍時(shí)，表示植物受到了脅迫。張永強(qiáng)等[16]研究顯示，水分虧缺使冬小麥Fv/Fm、Fv/F0、穩(wěn)態(tài)熒光(Ft)均顯著下降，PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率、PSⅡ潛在活性受到抑制，說明干旱脅迫直接影響了光合作用的電子傳遞和CO2同化。衣艷君等[17]研究表明，在脫水過程中毛尖紫萼蘚的Fv/Fm對葉片含水量的響應(yīng)存在相對含水量閾值，若低于此閾值則各熒光參數(shù)值會迅速下降。在本研究中，Mh-GD處理的Fv/Fm高于0.8，可能是因?yàn)槿~片相對含水量大于Fv/Fm的響應(yīng)閾值。孫山等[18]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)‘金太陽’杏葉片的RWC低于59%時(shí)，OJIP曲線和光吸收曲線形狀發(fā)生顯著變化，但對PSⅡ的Fv/Fm影響較??；光合性能指數(shù)PI比Fv/Fm能夠更加全面地反映PSⅠ和PSⅡ之間電子傳遞的變化，PI隨著干旱的加重而逐漸降低。這與本研究結(jié)果一致，表現(xiàn)為Mh-GD處理植株的PI顯著低于Mh-CK處理。

3.2 平邑甜茶葉片差異表達(dá)蛋白的功能

比較Mh-GD和Mh-CK處理平邑甜茶葉片的差異蛋白發(fā)現(xiàn)，與抗逆、蛋白質(zhì)合成代謝等過程相關(guān)的蛋白表達(dá)總體上調(diào)，而與光合途徑、細(xì)胞加工、碳代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程相關(guān)的差異蛋白表達(dá)總體下調(diào)。Mh-GD處理差異蛋白表達(dá)與Mh-CK處理相比有升有降，說明干旱脅迫通過抑制或提高平邑甜茶體內(nèi)某些蛋白的合成來增強(qiáng)植株對干旱環(huán)境的適應(yīng)性。

3.2.1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白 平邑甜茶通過信號感受器官感受外界的干旱刺激，然后把信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，從而關(guān)閉或啟動一些相關(guān)基因表達(dá)以達(dá)到抵御脅迫的目的。本研究發(fā)現(xiàn)了11種與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白。在植物中，G蛋白是活細(xì)胞內(nèi)一類具有重要生理調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)，它參與多種跨膜信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]，包括響應(yīng)植物體內(nèi)的激素信號與糖信號[20]，參與調(diào)控氣孔運(yùn)動[21]、對病原體的防衛(wèi)[22]，植物光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]等。本研究中，2個(gè)G蛋白A9PEC2和B9GQQ0表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。鈣網(wǎng)蛋白參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，可以作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，也可起存儲鈣離子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。本研究中的鈣網(wǎng)蛋白家族(B9N4Q4)表達(dá)下降。核苷二磷酸激酶2(NDPK2)是擬南芥光敏色素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)上游成分，參與光敏素A的響應(yīng)，它作用于光敏色素的C-末端，是介導(dǎo)光敏色素光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一種正調(diào)節(jié)信號組分[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)NDPK(U5GVG1和B9I3M0)表達(dá)量降低，說明它們參與平邑甜茶葉片在干旱脅迫下光信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。磷酸酶2C家族蛋白(PP2C)參與ABA負(fù)調(diào)控作用與保衛(wèi)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[25]。本研究中PP2C(B9HB91)表達(dá)下調(diào)，意味著在干旱脅迫下ABA含量增多。富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶(the leucine-rich repeats receptor-like protein kinase，LRR-RLK)是目前植物中最大的一類植物類受體蛋白激酶。Xing等[26]將楊樹中1個(gè)LRR-RLK基因PdERECTA在擬南芥中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株較野生型植株對水分的利用率提高。前人研究發(fā)現(xiàn)，LRR-RLK能夠介導(dǎo)逆境脅迫信號的感知及傳遞，對植物響應(yīng)逆境脅迫具有重要的調(diào)控作用[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下2個(gè)LRR-RLK(B9HD76和B9ILH3)表達(dá)下調(diào)。β-連環(huán)蛋白信號途徑在動物方面的研究較多，而在植物上鮮有報(bào)道，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號途徑在動物生長發(fā)育過程中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，犰狳/β-連環(huán)蛋白重復(fù)家族蛋白(B9HJD4)表達(dá)下調(diào)，但其功能尚不清楚。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中唯一上調(diào)的蛋白是肌動蛋白家族(B9GJJ1)。多種肌動蛋白結(jié)合蛋白參與動態(tài)微絲骨架的調(diào)節(jié)，在植物生長發(fā)育和逆境生理中發(fā)揮重要作用。本研究中肌動蛋白表達(dá)上調(diào)可能是參與響應(yīng)平邑甜茶葉片干旱脅迫下的應(yīng)答。

3.2.2 碳代謝蛋白 本研究發(fā)現(xiàn)，參與葡萄糖代謝、三羧酸循環(huán)(TCA)、GDP-甘露糖生物合成和淀粉合成等碳水化合物合成過程的酶分別為甘油-3-磷酸脫氫酶(U5GDS8)、蘋果酸酶(B9IKG4)、磷酸分解酶(A9PI53)、淀粉合成酶(B9I0S2)、糖基水解酶家族3蛋白(B9GUL0)及催化底物NADP依賴性山梨糖醇6-磷酸脫氫酶家族蛋白(B9HRF0)。它們具有氧化還原活性，表達(dá)均下降，可能是光合作用下降導(dǎo)致的。丙酮酸脫氫酶家族蛋白(B9GMQ4)和蘋果酸脫氫酶(A9P8R3)參與TCA，丙酮酸激酶(A9PFJ7)參與糖酵解(EMP)過程，這3種蛋白表達(dá)上調(diào)說明呼吸作用增強(qiáng)。在干旱脅迫下，光合碳同化的速率下降，細(xì)胞呼吸作用加強(qiáng)，碳水化合物消耗增加。纖維素是一種多糖物質(zhì)，也是植物細(xì)胞壁的重要組分，在干旱脅迫下植物為了維持細(xì)胞的形態(tài)和植物體的挺拔形態(tài)，合成纖維素的蛋白表達(dá)量上調(diào)。本研究中可逆糖基化多肽3家族蛋白(B9HIG2)表達(dá)上調(diào)可能是為了維持細(xì)胞的形態(tài)。

3.2.3 抗逆反應(yīng)蛋白 在逆境脅迫下，植物體會產(chǎn)生一些有害的化學(xué)物質(zhì)，導(dǎo)致自身受損，自由基、活性氧(ROS)是最常見的逆境有害物質(zhì)。ROS的性質(zhì)極其活潑，能夠與一切植物體內(nèi)的生物大分子反應(yīng)，從而破壞其活性構(gòu)象，打亂細(xì)胞正常代謝[29]。但細(xì)胞中也存在著超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等保護(hù)酶，可在干旱脅迫下清除ROS，維持代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)[30]。本研究中，抗氧化蛋白(A0A0B4SWQ5)、過氧化物酶(B9I6X4、C1KA94)表達(dá)下調(diào)，熱休克蛋白HSP70(U7DVX5、B9HTJ7和B9N9W6)和過氧化氫酶(B9H5I0和Q1XFN0)表達(dá)上調(diào)。隨著干旱程度的加劇，葉片SOD活性逐漸下降，POD活性隨著干旱加重則有不同程度增加；CAT活性在中度干旱脅迫下會有所增加而在重度干旱下會降低[31]。HSP70家族在熱休克蛋白家族中屬于最保守、最主要的一類。在大多數(shù)生物中，HSP70是含量最多的一類熱休克蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到脅迫后其含量會顯著提高，參與各種機(jī)體細(xì)胞的保護(hù)。HSP的誘導(dǎo)合成，可以穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞正常生理功能，使機(jī)體對逆境脅迫如熱害、冷害、病毒感染等相應(yīng)抵抗能力增加[32-34]。本研究中平邑甜茶可能通過上調(diào)CAT和HSP70表達(dá)來增強(qiáng)植物對干旱脅迫的抗性。

3.2.5 蛋白質(zhì)代謝 本研究中參與蛋白質(zhì)合成的酶類，如反向AMP依賴性合成酶和連接酶家族蛋白(U7DVH1)、脫水酶家族蛋白(B9H085)、反向ATP依賴性RNA解旋酶家族蛋白(B9I516)，以及翻譯起始因子eIF-1A家族蛋白(A9PE28)、網(wǎng)格蛋白組裝家族蛋白(B9GTT6)、延伸因子Tu家族蛋白(B9HAD7)和多種核糖體蛋白，如60S核糖體蛋白L23(A9P8I4)、40S核糖體蛋白S19(A9PGL4)、40S核糖體蛋白S3(B9IEM3)、40S核糖體蛋白S16(A9P9A0)和核糖體蛋白L6(B9IAF0)表達(dá)均上調(diào)，表明植物體通過增加一些相關(guān)蛋白的合成來抵御干旱脅迫。