朱作藝, 張 玉, 王君虹, 李 雪, 王 偉*, 楊 華, 朱 巖
(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所, 浙江 杭州 310021; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部創(chuàng)意農(nóng)業(yè)重點實驗室,浙江 杭州 310021; 3. 浙江大學(xué)化學(xué)系, 浙江 杭州 310028)
圖 1 肌肽、鵝肌肽及高肌肽的結(jié)構(gòu)式
肌肽(carnosine)是β-丙氨酸和L-組氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的二肽化合物,天然存在于脊椎動物骨骼肌和大腦等組織中。1900年俄國化學(xué)家古列維奇首次從牛肉提取物中分離出肌肽,后來被證實這是從天然原料中分離得到的第一個具有代表性的生物活性肽[1]。除肌肽外,在脊椎動物組織中同樣存在許多肌肽類化合物(CRCs),也稱組氨酸二肽類物質(zhì),包括鵝肌肽(anserine)和高肌肽(homocarnosine)等[2]。鵝肌肽是肌肽的甲基化衍生物,由β-丙氨酸和L-1-甲基組氨酸組成,為高度穩(wěn)定的水溶性二肽。高肌肽同樣為類組氨酸二肽,與肌肽、鵝肌肽具有相似的結(jié)構(gòu)(見圖1)和生物學(xué)功能[3],主要存在于腦脊液中。研究顯示,這類組氨酸二肽物質(zhì)具有顯著的抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗衰老、降尿酸、緩沖生理pH、舒張血管、保護(hù)神經(jīng)及調(diào)節(jié)酶活性等作用[4-10],是重要的功能因子,在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用。肌肽類化合物在食品工業(yè)中常作為添加劑,可以增強(qiáng)食品的風(fēng)味,使得肉制品味道鮮美,肉質(zhì)細(xì)嫩,同時大大延長食品保質(zhì)期[11];在醫(yī)藥領(lǐng)域可用以預(yù)防光敏性皮炎和治療白內(nèi)障等[12,13];在化妝品工業(yè)中具有促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝、延緩衰老和增白等功能[14]。因此,建立一種高效準(zhǔn)確的同時測定肌肽類化合物的方法具有重要意義。
目前,測定肌肽類化合物的分析方法主要是高效液相色譜法(HPLC),采用NH2柱[15]或C18柱[16]進(jìn)行分離,在波長210 nm下紫外檢測,但大多方法僅局限于肌肽或鵝肌肽的測定。由于肌肽類化合物紫外吸收弱,一般檢測靈敏度較低,同時肌肽類化合物疏水性較弱,一般采用C18柱進(jìn)行分離需進(jìn)行衍生[17,18]。Aristoy等[19]采用陽離子交換色譜-鄰苯二甲醛柱后衍生化法測定了飼料及肌肉組織中肌肽和鵝肌肽的含量。黃穎等[20]采用毛細(xì)管電泳法同時測定了腦脊液中的肌肽、鵝肌肽和高肌肽,該方法雖然柱效高,分離快速,所需樣品量少,但由于毛細(xì)管直徑小,光路短,采用紫外檢測時靈敏度較低,同時緩沖體系的pH值較難控制,易導(dǎo)致方法重現(xiàn)性不理想。Peiretti等[2]采用HPLC-MS測定不同動物肌肉中肌肽、鵝肌肽和高肌肽的含量;Macia等[21]采用UPLC-MS/MS測定了雞湯中肌肽和鵝肌肽的含量,但以上兩種方法所用儀器昂貴,一般實驗室難以實現(xiàn)。
離子色譜(IC)-電化學(xué)檢測作為一種高效分離檢測技術(shù),廣泛應(yīng)用于無機(jī)陰陽離子、糖類、醛醇類、氨基酸和含硫化合物等的檢測。積分脈沖安培檢測法(IPAD)是一種新形式的脈沖安培檢測法,克服了直流安培和脈沖安培的不足,成為當(dāng)今各行業(yè)檢測的重要手段之一[22]。本文建立了一種離子色譜-積分脈沖安培直接檢測肉類產(chǎn)品中鵝肌肽、高肌肽及肌肽含量的方法,與高效液相色譜法相比,該方法靈敏度高,且無需衍生化操作;與HPLC-MS等方法相比,該方法操作和維護(hù)成本低,結(jié)合簡單的樣品前處理過程,可應(yīng)用于肉類產(chǎn)品中肌肽類化合物含量的準(zhǔn)確測定。
Dionex ICS-3000離子色譜儀(配有帶在線脫氣裝置的四元梯度泵、電化學(xué)檢測器(三電極系統(tǒng):金電極為工作電極,pH-Ag/AgCl為參比電極,不銹鋼為對電極)、柱溫箱、Rheodyne六通閥(帶25 μL定量環(huán))、Chromeleon 6.80色譜工作站)、AminoPac PA10保護(hù)柱(50 mm×2 mm)、分離柱(250 mm×2 mm)、Dionex OnGuard II RP前處理小柱(1.0 mL)(美國Thermo Fisher公司); 0.22 μm尼龍濾膜過濾頭(天津毫津科技有限公司);JP-080S超聲波儀(深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司); Eppendorf臺式高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。
肌肽(純度98.0%)、鵝肌肽(純度98.0%)購自上海源葉生物科技股份有限公司;高肌肽(純度98.0%)購自杭州尚杰化工有限公司;17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(精氨酸、賴氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和酪氨酸)購自美國Sigma公司;50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH溶液購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純,實驗室用水均為18.2 MΩ5cm去離子水。
1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液及淋洗液的配制
分別稱取一定量的鵝肌肽、高肌肽及肌肽標(biāo)準(zhǔn)品,置于50 mL容量瓶中,用去離子水定容,分別配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的鵝肌肽、高肌肽及肌肽標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?用去離子水將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
100 mmol/L NaOH淋洗液:準(zhǔn)確移取5.2 mL 50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH溶液,置于1.0 L容量瓶中,加入去離子水定容至刻度,混勻,使用時施加氮氣保護(hù),防止淋洗液吸收空氣中的CO2。
1.2.2樣品前處理
將新鮮鴨、鵝胸肉切成約1 cm3立方體小塊,采用高速組織搗碎機(jī)破碎勻漿3 min;準(zhǔn)確稱取2.0 g肉泥,加入一定量去離子水,于30 ℃下超聲提取30 min,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中并定容,然后以12 000 r/min離心15 min,取上清液,再稀釋20倍。
依次用5 mL甲醇和10 mL去離子水活化OnGuard II RP前處理小柱,然后將稀釋后的樣品上清液依次經(jīng)過0.22 μm尼龍濾膜和OnGuard II RP前處理小柱,棄去最先流出的3 mL樣品流出液,收集隨后的2 mL樣品流出液,用于離子色譜測定。
1.2.3色譜條件
色譜柱為Thermo Scientific AminoPac PA10保護(hù)柱(50 mm×2 mm)和分離柱(250 mm×2 mm);柱溫為30 ℃;采用100 mmol/L NaOH溶液等度淋洗;流速為0.2 mL/min;進(jìn)樣體積為25 μL;檢測方式為積分脈沖安培檢測。檢測電位波形見表1。
表 1 積分脈沖安培檢測的電位波形
從圖1可以看出,鵝肌肽、高肌肽及肌肽均為組氨酸二肽類化合物,三者均具有相似的兩性離子結(jié)構(gòu),在堿性介質(zhì)中,以陰離子狀態(tài)存在,因此可以采用高效陰離子交換色譜柱進(jìn)行分離,且堿性條件滿足積分脈沖安培檢測的必需條件。為研究鵝肌肽、高肌肽及肌肽的保留行為,對一系列固定相和流動相進(jìn)行選擇和優(yōu)化。由于兩性離子化合物保留較弱,因此選用兩種高交換容量的陰離子交換色譜柱(CarboPac MA1和AminoPac PA10)對化合物進(jìn)行分離。實驗結(jié)果表明,調(diào)節(jié)淋洗液濃度和流速,3種目標(biāo)化合物依然無法在CarboPac MA1色譜柱上實現(xiàn)完全分離;而采用AminoPac PA10色譜柱時,3種目標(biāo)化合物在保留時間和分離度方面均優(yōu)于CarboPac MA1色譜柱。因此,本實驗選用Amino-Pac PA10色譜柱分離鵝肌肽、高肌肽及肌肽。
圖 2 采用不同(a)流速和(b)濃度的淋洗液時3種目標(biāo)化合物的色譜圖
方法考察了不同流速(0.15、0.20和0.25 mL/min)對3種目標(biāo)化合物分離效果的影響(見圖2a)。結(jié)果表明,當(dāng)淋洗液NaOH的濃度固定為100 mmol/L時,隨著流速的增加,3種目標(biāo)化合物的保留時間相應(yīng)減少。當(dāng)流速為0.15 mL/min時,3種目標(biāo)化合物在18 min內(nèi)出峰,肌肽出現(xiàn)輕微拖尾現(xiàn)象;當(dāng)流速為0.20 mL/min時,3種目標(biāo)化合物在14 min內(nèi)出峰,可實現(xiàn)完全分離;當(dāng)流速為0.25 mL/min時,3種目標(biāo)化合物在12 min內(nèi)出峰,其中鵝肌肽保留時間接近死時間。綜合以上實驗結(jié)果,選擇淋洗液流速0.20 mL/min為最佳優(yōu)化條件。
另外,實驗對不同濃度的NaOH淋洗液進(jìn)行了考察(見圖2b)。當(dāng)采用80 mmol/L NaOH溶液淋洗時,3種目標(biāo)化合物在16 min內(nèi)全部出峰,但3種目標(biāo)化合物均存在拖尾現(xiàn)象,尤其是鵝肌肽拖尾嚴(yán)重;當(dāng)采用100 mmol/L NaOH溶液淋洗時,3種目標(biāo)化合物在14 min內(nèi)全部出峰,峰形對稱;當(dāng)NaOH淋洗液濃度提高至120 mmol/L時,3種目標(biāo)化合物的保留時間變化不大,只有高肌肽和肌肽保留時間略有提前。綜合以上實驗結(jié)果,選擇淋洗液100 mmol/L NaOH。
為驗證最佳淋洗液條件下17種氨基酸對目標(biāo)化合物是否存在干擾,配制17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,依次對其和目標(biāo)化合物進(jìn)行測定。從圖3可以看出,在30 min內(nèi)只有部分氨基酸出峰,其保留時間均不與3種目標(biāo)化合物的保留時間接近,不對3種目標(biāo)化合物產(chǎn)生干擾。
圖 3 (a)氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和(b)3種目標(biāo)化合物的色譜圖
根據(jù)文獻(xiàn)[21]報道,肉類樣品絞碎成肉泥再經(jīng)后續(xù)處理,其肌肽類化合物的提取效率明顯高于樣品切丁處理,而絞碎后的肉泥樣品采用攪拌、超聲和高溫蒸煮3種提取方式對肌肽類化合物的提取沒有顯著性差異,但高溫蒸煮方式容易造成細(xì)胞內(nèi)肌漿蛋白溶出,使樣品提取液基質(zhì)更為復(fù)雜。因此,本文以去離子水為提取溶劑,采用超聲方式對肉泥樣品中的肌肽類化合物進(jìn)行提取,提取溫度為30 ℃。同時分別考察了不同提取時間(10、20、30、40、50和60 min)對鴨胸肉泥樣品中3種目標(biāo)化合物提取效率的影響(n=2)。從圖4可以看出,在10~30 min內(nèi),隨著提取時間的增加,3種目標(biāo)化合物的提取效率均有上升趨勢,當(dāng)提取時間為30 min時,3種目標(biāo)化合物的提取效率達(dá)到最高;當(dāng)提取時間大于30 min,3種目標(biāo)化合物的含量基本保持不變。因此,本實驗選擇最優(yōu)提取時間為30 min。
圖 4 提取時間對肉類樣品中3種目標(biāo)化合物提取效率的影響
采用優(yōu)化后的色譜條件,分別對6個濃度梯度的鵝肌肽、高肌肽及肌肽混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定,以相應(yīng)的色譜峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x, mg/L)進(jìn)行線性回歸。3種目標(biāo)化合物在0.05~5.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999 2。將質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行分析,連續(xù)進(jìn)樣6次,其保留時間、色譜峰高和色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.28%~0.33%、0.52%~1.97%和0.66%~1.81%,表明該方法具有較好的重復(fù)性。根據(jù)信噪比(S/N)為3和10時的結(jié)果計算3種目標(biāo)化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為8.9~22.1 μg/L和29.6~73.6 μg/L(見表2)。根據(jù)文獻(xiàn)[15-17]報道,采用常規(guī)的高效液相色譜-紫外檢測法測定肌肽類化合物,其檢出限為160~1 600 μg/L。與常用的液相色譜法相比,本方法在靈敏度方面具有一定優(yōu)勢。
表 2 3種目標(biāo)化合物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差
y: peak area;x: mass concentration, mg/L.
根據(jù)1.2.2節(jié)樣品前處理方法和1.2.3節(jié)色譜條件,分別對鴨胸肉(見圖5a)和鵝胸肉(見圖5b)樣品進(jìn)行測定,通過外標(biāo)法定量。由圖5可以看出,鴨胸肉和鵝胸肉樣品中均存在鵝肌肽、高肌肽和肌肽。
圖 5 (a)鴨胸肉和(b)鵝胸肉樣品中3種目標(biāo)化合物的色譜圖
為考察方法的準(zhǔn)確性,分別在樣品中加入3種目標(biāo)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,加標(biāo)樣品經(jīng)提取、凈化后,平行測定3次。
結(jié)果表明,3種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率為92.4%~104.5%, 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%~2.4%(見表3)。
表 3 實際樣品的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差
本文建立了一種簡單快速的離子色譜-積分脈沖安培同時測定肉類樣品中鵝肌肽、高肌肽及肌肽的分析方法。通過線性、選擇性、靈敏度、精密度以及準(zhǔn)確度等一系列方法學(xué)驗證,表明該方法簡單高效,線性范圍寬,具有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確度,適用于肉類產(chǎn)品中肌肽、鵝肌肽及高肌肽的測定,為肉類產(chǎn)品品質(zhì)營養(yǎng)評價提供了一種新型、簡便、高效的分析方法。