高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂膠及以其為原料的保健食品中的氯霉素

溫家欣, 吳鳳丹, 曹雅靜, 何嘉雯, 黃志業(yè), 黃艷婷, 譚婉清, 羅文靜, 賴宇紅

(廣東省藥品檢驗所, 廣東 廣州 510663)

蜂膠是工蜂采集植物樹脂等分泌物后與自身上顎腺、蠟腺等分泌物混合而成的膠黏性物質(zhì)[1]。蜂膠是傳統(tǒng)中藥,具有多種生物學活性,如抗氧化、抗炎、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、保肝護肝、抗癌等[2],廣泛應用于保健食品、藥品和化妝品等行業(yè)中,是近十多年來蜂產(chǎn)品乃至天然產(chǎn)物研發(fā)的熱點之一[3]。自2002年我國出口歐盟的蜂蜜檢出氯霉素后,我國蜂產(chǎn)品的出口貿(mào)易形勢比較嚴峻,蜂產(chǎn)品中的獸藥殘留問題已成為影響其食用安全最主要的因素,成為學術界的研究熱點。

氯霉素是一種廣譜抗生素,是預防和治療蜜蜂細菌性疾病的有效藥物之一。但由于氯霉素能在蜂產(chǎn)品中殘留,對人類的造血系統(tǒng)有嚴重不良反應,許多國家已將其列入食品中禁止使用的藥物名單[4]。目前,關于蜂蜜、蜂王漿及其相關制品中氯霉素殘留量檢測方法的報道較多,主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5,6]、氣相質(zhì)譜法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]等,但關于蜂膠及以其為原料的保健食品的報道較少[4,9-11]。對于蜂膠原料,普遍采用氫氧化鈉溶液、乙醇、甲基叔丁基醚溶解,以乙酸鉛溶液、氫氧化鈉溶液為沉淀劑去除黃酮,最后以乙酸乙酯萃取的方法進行前處理[4,9,10]。對于以蜂膠為原料的保健食品,其主要劑型為軟膠囊和硬膠囊,由于制劑輔料(如聚乙二醇400、明膠、甘油、植物油、淀粉、微晶纖維素等)的加入,其樣品基質(zhì)更為復雜。對于軟膠囊劑,部分輔料(如聚乙二醇400)的添加量較大,溶解特性與氯霉素相似,使用常用的氯霉素提取溶劑(乙酸乙酯、乙腈等)將產(chǎn)生較嚴重的共提取,導致樣品難以濃縮[11],影響方法的靈敏度和抗干擾性;對于硬膠囊劑,部分輔料(如淀粉、微晶纖維素等)遇極性較低的有機溶劑容易產(chǎn)生膠狀物,不利于氯霉素的提取。因此,選擇合適的提取溶劑、凈化手段和萃取溶劑,是前處理方法研究的重點。

本文根據(jù)蜂膠原料及以蜂膠為原料的保健食品的基質(zhì)特點,開發(fā)了一個同時適用于這兩類樣品的氯霉素測定方法。本方法具有操作簡便、靈敏度高、抗干擾能力強、定性定量準確、推廣應用前景良好的優(yōu)點,為蜂膠產(chǎn)品氯霉素殘留監(jiān)管問題提供了有效的技術支撐手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20ADXR液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司), Triple Quad 5500串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(配ESI)(美國Sciex公司), MS 3 digital渦旋振蕩器(德國IKA公司), ST16R離心機(美國Thermo Fisher公司), Hei-VAP Advan旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司), Mili-Q Advantage A10超純水發(fā)生器(美國Millipore公司)。

氯霉素標準物質(zhì)(CAP,純度99.0%)和氯霉素-D5標準物質(zhì)溶液(CAP-D5, 100 mg/L)(德國Dr. Ehrenstorfer公司);無水乙醇、三水合乙酸鉛、冰醋酸、氨水、正己烷(分析純,廣州光華試劑廠);甲基叔丁基醚和乙腈(色譜純,美國Honeywell公司)。

1.2 實驗條件

1.2.1HPLC-MS/MS條件

色譜柱:Thermo Accucore C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL;流動相:A為水,B為乙腈;梯度洗脫程序:0～2.0 min, 20%B; 2.0～5.0 min, 20% B～90%B; 5.0～7.0 min, 90%B; 7.0～7.5 min, 90%～20%B; 7.5～10.0 min, 20%B。

采用ESI源,負離子模式檢測。電噴霧電壓:-4 500 V;離子源溫度:550 ℃;霧化氣壓力:3.447 5×105Pa;氣簾氣壓力:2.758×105Pa;碰撞氣壓力:6.205 5×104Pa;檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM)。其他質(zhì)譜條件見表1。

表 1 氯霉素、氯霉素-D5 的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

1.2.2溶液配制

4%(質(zhì)量分數(shù),下同)乙酸鉛溶液:稱取20 g三水合乙酸鉛,用水溶解,加入2.5 mL冰醋酸,加水至500 mL,混勻。

準確稱取10 mg氯霉素標準物質(zhì),用乙腈配成500 mg/L的標準儲備溶液。準確移取適量氯霉素-D5標準物質(zhì)溶液,用乙腈稀釋成100 μg/L的內(nèi)標工作溶液。

取適量氯霉素標準儲備溶液、氯霉素-D5內(nèi)標工作溶液,用乙腈-水(1∶1, v/v)配制成氯霉素質(zhì)量濃度為0.20～50.0 μg/L、內(nèi)標氯霉素-D5質(zhì)量濃度為10 μg/L的標準工作曲線。

1.2.3樣品前處理

將蜂膠原膠置于-18 ℃冷凍2 h,取出后立即敲碎,敲碎后的樣品作為供試樣品。以蜂膠為原料的保健食品直接取膠囊內(nèi)容物。

稱取試樣2.00 g,置于50 mL離心管中,加入100 μL氯霉素-D5工作溶液(100 μg/L)和無水乙醇(蜂膠、硬膠囊加4 mL,軟膠囊加2 mL),渦旋振蕩10 min(硬膠囊經(jīng)無水乙醇提取后需以8 000 r/min的速度離心10 min,上清液用濾紙過濾至另一50 mL離心管中,濾紙上的殘渣用1～2 mL無水乙醇洗滌,濾液備用)。加入10 mL水,渦旋3 min,再加入10 mL 4%乙酸鉛溶液,渦旋3 min,以8 000 r/min的速度離心5 min。上清液傾入另一50 mL離心管中,殘渣加入5 mL 4%乙酸鉛溶液,渦旋3 min,以8 000 r/min的速度離心5 min,合并上清液于同一50 mL離心管。上述清液用氨水調(diào)節(jié)pH至10～11,混勻后靜置5 min,以8 000 r/min的速度離心5 min。上清液傾入50 mL離心管中,加入10 mL正己烷,渦旋振蕩5 min,以8 000 r/min的速度離心5 min,棄去上層溶液。再加入10 mL甲基叔丁基醚,渦旋振蕩5 min,以8 000 r/min的速度離心5 min,取上層清液于雞心瓶。重復提取1次,合并提取液于同一雞心瓶。于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,加入1 mL乙腈-水(1∶1, v/v)復溶。復溶液通過0.22 μm有機相濾膜至樣品瓶,待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

蜂膠可溶于2%氫氧化鈉溶液、乙醇[9],氯霉素易溶于甲醇、乙醇、丁醇、乙酸乙酯、丙酮。由于硬膠囊劑一般使用淀粉作為內(nèi)容物輔料,使用2%氫氧化鈉溶液、0.5%氫氧化鈣懸濁液[11]處理,會使淀粉發(fā)生糊化,導致氯霉素包裹其中,嚴重影響試樣中氯霉素的提取。而無水乙醇能有效溶解蜂膠,但不溶解硬膠囊劑常用輔料(淀粉、微晶纖維素等)和軟膠囊劑常用輔料(明膠),通過離心、過濾即可去除大量輔料成分的共提取。為提高前處理方法的通用性,降低后續(xù)凈化處理的難度,本方法采用無水乙醇對蜂膠及以蜂膠為原料的保健食品中的氯霉素進行提取。

2.2 凈化方式的選擇

蜂蜜、蜂王漿樣品的凈化過程主要采用液液萃取[6,12,13]、固相萃取[14-16]、液液萃取與固相萃取相結(jié)合[5,17]、QuEChERS[18,19]等方式凈化。但由于蜂膠的成分與蜂蜜、蜂王漿有很大的差別,基質(zhì)更加復雜,使用液液萃取的方式不能除去蜂膠中的大量黃酮類成分[4]。以蜂膠為原料的軟膠囊劑保健食品,由于制劑輔料(如聚乙二醇400、甘油)的大量加入,使氯霉素在固相萃取柱、分子印跡柱中的保留行為發(fā)生變化。因此,本方法采用4%乙酸鉛溶液沉淀具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類干擾物[4],在堿性條件下進一步去除不含此結(jié)構(gòu)的黃酮類干擾物[9],同時,堿性條件下更利于后續(xù)有機溶劑對氯霉素的萃取。另外,由于蜂膠約含30%蜂蠟,以蜂膠為原料的軟膠囊劑保健食品常以植物油(如大豆油、玉米油等)作為輔料,因此本方法使用正己烷去除樣品中蠟質(zhì)、脂類及脂溶性雜質(zhì)的干擾。

2.3 萃取溶劑的選擇

針對氯霉素常用的萃取溶劑主要有乙酸乙酯、乙腈、堿性乙酸乙酯和堿性乙腈[20]。對于軟膠囊劑,聚乙二醇400是常用的制劑輔料,是一種非離子型的水溶性聚合物,在極性較大的溶劑中有很好的溶解性,且添加量較大,使用乙酸乙酯、乙腈等作為萃取溶劑會產(chǎn)生嚴重的共提取,導致樣品難以濃縮[11],影響方法的靈敏度,帶來嚴重的基質(zhì)干擾。因此,選擇一種合適的萃取溶劑至關重要。本方法采用甲基叔丁基醚作為溶劑,在堿性條件下對凈化液中的氯霉素進行萃取,有效減少樣品中極性干擾物和制劑輔料(聚乙二醇400、甘油等)的共提取。

2.4 線性范圍、檢出限與定量限

配制質(zhì)量濃度為0.20～50.0 μg/L的氯霉素標準工作溶液,以氯霉素與氯霉素-D5的峰面積比值為縱坐標y、氯霉素的質(zhì)量濃度為橫坐標x(單位:μg/L)進行線性回歸,回歸方程為y=0.083 9x-0.011 9,相關系數(shù)r=0.999 8,線性關系良好。在空白基質(zhì)溶液中添加不同濃度的氯霉素標準溶液,按取樣量2.0 g、定容體積為1 mL計算,當信噪比(S/N)≥3時,氯霉素標準溶液質(zhì)量濃度為0.06 μg/L,方法檢出限為0.03 μg/kg;當S/N≥10時,氯霉素標準溶液濃度為0.20 μg/L,方法定量限為0.1 μg/kg。

2.5 方法學考察

由于蜂膠原料、以蜂膠為原料的保健食品的基質(zhì)差異較大,保健食品不同劑型的制劑輔料的組成差異顯著,應分別對蜂膠原膠、以蜂膠為原料的保健食品(硬膠囊劑)、以蜂膠為原料的保健食品(軟膠囊劑)3類樣品進行考察。其中,由于軟膠囊劑中常見的制劑輔料聚乙二醇400與蜂蠟、植物油等低極性輔料不配伍,所以以蜂膠為原料的軟膠囊通常有兩種輔料配伍方式,一種是含有聚乙二醇400但不含蜂蠟、植物油等低極性物質(zhì),另一種是含有蜂蠟、植物油但不含聚乙二醇400。本文對上述4種基質(zhì)進行考察,各基質(zhì)在低、中、高3個水平的加標回收率見表2,回收率為86.0%～114.4%。

PEG 400: polyethylene glycol 400.

2.6 基質(zhì)效應評價

基質(zhì)效應是由基質(zhì)中的共提取干擾物與目標化合物競爭電離所致[21]。為評價基質(zhì)效應,本文使用4種不同基質(zhì)的空白基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度為0.20～50.0 μg/L的標準工作溶液,以外標法制作標準曲線,采用(基質(zhì)匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1)×100%進行評價,負值表示存在抑制效應,正值表示存在增強效應,絕對值越大表示基質(zhì)效應越強[22]。由表3可見,不同基質(zhì)的樣品,基質(zhì)效應均小于7%,表明基質(zhì)效應較弱,本方法具有良好的凈化效果。

2.7 實際樣品檢測

應用本方法對5批不同廠家蜂膠原料、18批以蜂膠為主要原料的保健食品進行檢測。其中,蜂膠原料均未檢出氯霉素;5批以蜂膠為原料的保健食品(1批硬膠囊和4批軟膠囊)檢出氯霉素,陽性率為27.7%,含量為0.23～21.66 μg/kg,結(jié)果見表4。氯霉素標準溶液及典型樣品提取離子流色譜圖見圖1。

表 3 4種不同基質(zhì)的基質(zhì)效應評價

表 4 23批樣品中氯霉素含量測定結(jié)果

表 4 (續(xù))

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圖 1 氯霉素標準溶液及典型樣品提取離子流(XIC)色譜圖

3 結(jié)論

本文根據(jù)蜂膠原料及以蜂膠為原料的保健食品的基質(zhì)特點,開發(fā)了同時適用于這兩類樣品的氯霉素測定方法。以乙酸鉛溶液沉淀具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類干擾物,在堿性條件下進一步去除不含此結(jié)構(gòu)的黃酮類干擾物,并以甲基叔丁基醚為提取溶劑,有效減少樣品中極性干擾物和保健食品輔料(如聚乙二醇、甘油等)的共提取,具有通用性強、操作簡便、靈敏度高、抗干擾能力強、推廣應用前景良好的優(yōu)點,可滿足實際檢驗工作的需要。