錢 晨, 方紅霞, 蔡 群, 蔡 方, 高新宇, 李丹丹

(黃山學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所, 安徽 黃山 245041)

木質(zhì)素是為數(shù)不多的能提供巨量芳烴化合物的天然產(chǎn)物,它是由苯丙烷單體通過(guò)醚鍵以及碳-碳單鍵相連構(gòu)成的復(fù)雜高分子[1]。木質(zhì)素磺酸鹽來(lái)自制漿造紙廢液,磺酸基團(tuán)決定了其具有良好的水溶性,作為一種聚電解質(zhì),它們具有表面活性劑性質(zhì),可以作為助劑廣泛應(yīng)用在建筑、農(nóng)業(yè)和輕工等行業(yè)[2,3]。由于具有較寬的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍,木質(zhì)素磺酸鹽不同級(jí)份的結(jié)構(gòu)和性能差異較大,目前通常采用透析法、超濾法、溶劑分餾法和制備色譜法等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分級(jí)分離,以期提高其應(yīng)用性能和拓展其應(yīng)用范圍[4-6]。

快速準(zhǔn)確地測(cè)定不同級(jí)分木質(zhì)素的平均相對(duì)分子質(zhì)量及其分布是評(píng)價(jià)分級(jí)分離效果的重要指標(biāo)之一。凝膠色譜法是一種基于體積排除原理的測(cè)試方法,以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的稱為凝膠滲透色譜(GPC),而以水相溶液為流動(dòng)相的稱為凝膠過(guò)濾色譜(GFC)。由于凝膠色譜法可以同時(shí)測(cè)定物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布,是目前測(cè)定高聚物相對(duì)分子質(zhì)量的首選方法[7-9],已被廣泛應(yīng)用在分析測(cè)試木質(zhì)素相對(duì)分子質(zhì)量的研究中[10-12]。傳統(tǒng)凝膠色譜采用5 μm或者大于5 μm粒徑的凝膠柱,有機(jī)相和水相都易使其產(chǎn)生溶脹和腐蝕現(xiàn)象。此類凝膠柱無(wú)法耐受高壓,分辨率低,重現(xiàn)性較差,且單針運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)。木質(zhì)素磺酸鹽等親水性強(qiáng)的樣品不溶于有機(jī)溶劑,也無(wú)法進(jìn)行甲基化或乙?；磻?yīng),只能在親水性聚合物色譜柱上用水溶性流動(dòng)相淋洗;為了克服離子排斥、吸附等非體積排阻因素的影響,大多需要采用復(fù)雜的色譜條件進(jìn)行分析,一直未能獲得較為理想的測(cè)試結(jié)果[13,14]。

近年推出的超高效聚合物色譜法(APC),由于采用一種亞3 μm、剛性雜化顆粒填料的色譜柱,具有分析速度快、吸附低、耐高壓、耐溶劑、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)[15-17],特別是在測(cè)試低聚物時(shí)具有分辨率高的優(yōu)勢(shì),為木質(zhì)素磺酸鹽及其分級(jí)分離產(chǎn)物的分析提供了很好的技術(shù)條件。近期,本課題組[18]初步建立了采用APC水性柱分析酸催化木質(zhì)素磺酸鹽解聚前和解聚后殘?jiān)鄬?duì)分子質(zhì)量的方法,直觀地證實(shí)了木質(zhì)素被解聚后殘?jiān)南鄬?duì)分子質(zhì)量及其分布性質(zhì)。同時(shí),在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),由于其聚電解質(zhì)性質(zhì),離子排斥、吸附等非體積排阻效應(yīng)仍不可忽略,一定程度上影響了測(cè)試結(jié)果的分辨率和穩(wěn)定性。本文在以上分析工作的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化和探索采用水溶性超高效聚合物色譜高效分離和解析水溶性天然高分子木質(zhì)素磺酸鹽及其分級(jí)分離產(chǎn)物的方法,為木質(zhì)素及其分級(jí)分離產(chǎn)物的表征、性能研究提供科學(xué)可行的方法途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及原料

超高效聚合物色譜系統(tǒng):ACQUITY APC等度溶劑管理器,ACQUITY APC樣品管理器,ACQUITY單區(qū)間柱管理器,ACQUITY示差(RI)檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)。

葡聚糖窄分布標(biāo)準(zhǔn)品(簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Waters公司),峰位相對(duì)分子質(zhì)量(Mp)為180～4.015×105Da。超濾杯、再生纖維素超濾膜(德國(guó)Amicon公司),木質(zhì)素磺酸鈉(工業(yè)級(jí),阿拉丁公司),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)色譜純。高純水由Millipore Rios 50型去離子水機(jī)(德國(guó)Millipore公司)制備后經(jīng)Millipore A10純水機(jī)(德國(guó)Millipore公司)純化。

1.2 木質(zhì)素磺酸鹽超濾組分的制備

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的木質(zhì)素磺酸鹽水溶液,過(guò)濾去除不溶物,分別選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為1×104和3×104Da的再生纖維素超濾膜對(duì)木質(zhì)素磺酸鹽溶液進(jìn)行超濾分級(jí)分離,得到3種不同相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)組分的木質(zhì)素磺酸鹽:組分1(截留相對(duì)分子質(zhì)量大于3×104Da)、組分2(截留相對(duì)分子質(zhì)量小于3×104Da、大于1×104Da)和組分3(截留相對(duì)分子質(zhì)量小于1×104Da)。分級(jí)樣品經(jīng)旋蒸濃縮后、冷凍干燥得到固體粉末樣品。

1.3 APC實(shí)驗(yàn)條件

選用3根水相色譜柱(AQ)串聯(lián)進(jìn)行測(cè)試,分別是45 nm色譜柱(有效相對(duì)分子質(zhì)量范圍為2×104～4×105Da, 150 mm×4.6 mm, 2.5 μm)、20 nm色譜柱(有效相對(duì)分子質(zhì)量范圍為3×104～7×104Da, 150 mm×46 mm, 2.5 μm)和4.5 nm色譜柱(有效相對(duì)分子質(zhì)量范圍為2×102～5×103Da, 150 mm×4.6 mm, 1.7 μm)。流動(dòng)相:0.1 mol/L NaNO3水溶液;柱溫:40 ℃;示差折光檢測(cè)器:40 ℃;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:10μL;待測(cè)樣品含量:0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

1.4 APC測(cè)試方法

采取單標(biāo)進(jìn)樣方式,即選取系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品,分別用流動(dòng)相溶解,于室溫下靜置12 h,置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中進(jìn)樣測(cè)試,并用葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品作APC標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)溶液含量為0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。用流動(dòng)相溶解木質(zhì)素磺酸鹽和分級(jí)分離后的木質(zhì)素,于室溫下靜置12 h后過(guò)0.45 μm水相濾膜,置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中,使用寬分布未知樣法進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相的影響

APC采用小顆粒亞乙基橋雜化二氧化硅改性凝膠色譜柱,雖然相比于凝膠聚合物色譜柱,具有出色的柱效、低吸附、巨大的機(jī)械穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn),然而由于木質(zhì)素磺酸鹽的電解質(zhì)特性,使其在色譜柱中進(jìn)行分離時(shí)并非只有單純的體積排阻作用,故有可能導(dǎo)致結(jié)果偏差。消除非體積排阻效應(yīng)可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值和離子強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)。

首先研究了流動(dòng)相pH值對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,結(jié)果如圖1所示,使用pH 9.0的NaOH溶液為流動(dòng)相,木質(zhì)素磺酸鹽樣品色譜峰出峰時(shí)間大大提前,且分離效果很差,這可能是在高pH值下,離子排除效應(yīng)增強(qiáng)的結(jié)果。采用pH 3.0的甲酸溶液作為流動(dòng)相,色譜峰出現(xiàn)了分離,但色譜峰出峰時(shí)間整體延后,說(shuō)明樣品在色譜柱上產(chǎn)生了吸附,這和文獻(xiàn)[19,20]的描述是一致的。而采用pH 7.0的純水作為流動(dòng)相,雖然開始能得到分離度較好的譜圖,但色譜柱經(jīng)過(guò)幾次使用,色譜峰的數(shù)目和面積都會(huì)減少,說(shuō)明木質(zhì)素磺酸鹽樣品仍會(huì)在色譜柱上產(chǎn)生吸附,因此進(jìn)一步考慮在純水中加入鹽離子來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

圖 1 不同pH值流動(dòng)相測(cè)得的木質(zhì)素磺酸鹽的APC圖譜

在參照文獻(xiàn)和前期研究的基礎(chǔ)上[18,21],采用近中性的不同濃度NaNO3水溶液作為離子強(qiáng)度不同的流動(dòng)相進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果如表1所示,在pH值相同時(shí),隨著流動(dòng)相離子強(qiáng)度的升高,色譜峰面積逐漸增大,這表明離子強(qiáng)度的升高有利于減少木質(zhì)素磺酸鹽在色譜柱上的吸附。同時(shí),隨著離子強(qiáng)度的升高,色譜峰的保留時(shí)間也略有延長(zhǎng),說(shuō)明離子強(qiáng)度的增加也能減小木質(zhì)素分子在流動(dòng)相中的膨脹以及木質(zhì)素分子間的排斥。但離子強(qiáng)度較高時(shí),系統(tǒng)的運(yùn)行壓力升高,不利于試驗(yàn)的進(jìn)行。綜合上述結(jié)果,選用pH 6.8的0.1 mol/L NaNO3水溶液作為流動(dòng)相。

表 1 不同離子強(qiáng)度的流動(dòng)相對(duì)木質(zhì)素磺酸鹽APC測(cè)試數(shù)據(jù)的影響

Time: the retention time of the highest peak. Area: the area of the whole chromatogram.

2.1.2流速及進(jìn)樣量的影響

首先考察了流動(dòng)相流速為0.3、0.5和0.8 mL/min時(shí)對(duì)木質(zhì)素磺酸鹽樣品分離度的影響,3種流速下木質(zhì)素磺酸鹽樣品均能進(jìn)行有效分離。當(dāng)流速為0. 3 mL/min時(shí),所需分析時(shí)間較長(zhǎng);當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí),分析時(shí)間較短但系統(tǒng)運(yùn)行壓力較高,且色譜峰的分辨率有所下降,因此選擇0.5 mL/min作為測(cè)試流速。傳統(tǒng)凝膠色譜中3根色譜柱串聯(lián)分析1個(gè)樣品需要30 min以上[19],而在該條件下,分析1個(gè)樣品所需時(shí)間僅為12 min,大大縮短了分析時(shí)間。同時(shí)還考察了樣品進(jìn)樣量的影響。將木質(zhì)素磺酸鹽配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的樣品,進(jìn)樣量分別為20、10、5和2.5 μL,在不同的進(jìn)樣量下,樣品的出峰時(shí)間基本不變,說(shuō)明進(jìn)樣量對(duì)木質(zhì)素磺酸鹽樣品的分離效果影響不明顯,因此選定10 μL為測(cè)試進(jìn)樣量。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在以pH 6.8的0.1 mol/L NaNO3水溶液為流動(dòng)相,采用3根Waters水溶性色譜柱串聯(lián),進(jìn)樣量為10 μL,流速為0.5 mL/min的條件下,同時(shí)考慮到木質(zhì)素磺酸鹽的親水性及其官能團(tuán)多樣、成分復(fù)雜等特點(diǎn),選用葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,用流動(dòng)相溶解系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試結(jié)果顯示,不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)串聯(lián)色譜柱得到了有效且快速的分離,出峰時(shí)間隨著相對(duì)分子質(zhì)量的遞減而遞增,其相對(duì)分子質(zhì)量與對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間見(jiàn)表2。以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),出峰時(shí)間為橫坐標(biāo),由Waters APC自帶的Empower軟件擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,其曲線判定系數(shù)r=0.999 8,該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)試范圍為180～4.015×105Da,能滿足木質(zhì)素磺酸鹽及其分級(jí)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)試要求。

表 2 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰位相對(duì)分子質(zhì)量及保留時(shí)間

圖 2 木質(zhì)素磺酸鹽的APC圖譜

2.3 木質(zhì)素磺酸鹽及其膜分離產(chǎn)物的測(cè)試

2.3.1木質(zhì)素磺酸鹽的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布

用流動(dòng)相溶解木質(zhì)素磺酸鹽配成0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的待測(cè)液,按1.3節(jié)方法進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果表明,該木質(zhì)素磺酸鹽的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量(Mn)為2 245 Da,重均相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)為18 934 Da,聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index, PDI)為8.44,分布較寬。從圖2可以看出,相比純水流動(dòng)相(見(jiàn)圖1b)以及先前報(bào)道方法[18]的測(cè)試結(jié)果,本試驗(yàn)由于采用了pH 6.8的0.1 mol/L NaNO3水溶液為流動(dòng)相,降低了離子排斥和吸附等非體積排阻效應(yīng)的影響,木質(zhì)素磺酸鹽的色譜圖具有更多的精細(xì)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)色譜分離后該木質(zhì)素磺酸鹽的相對(duì)分子質(zhì)量分布在8個(gè)區(qū)間,相對(duì)分子質(zhì)量從幾百到幾萬(wàn)。從表3可以看出,每個(gè)區(qū)間的PDI都在1.0～1.2之間,說(shuō)明在此實(shí)驗(yàn)條件下,木質(zhì)素磺酸鹽在色譜柱中實(shí)現(xiàn)了高效的分離。

表 3 木質(zhì)素磺酸鹽的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布指數(shù)

Mw: weight average relative molecular mass;Mn: number average relative molecular mass.

2.3.2水溶性APC檢測(cè)木質(zhì)素磺酸鹽的重現(xiàn)性

為了驗(yàn)證APC測(cè)試方法的重現(xiàn)性,分別在3天內(nèi)對(duì)同一木質(zhì)素磺酸鹽樣品進(jìn)行了測(cè)試,由表4可知,3次測(cè)試的木質(zhì)素磺酸鹽的Mw、Mn和PDI數(shù)值變化不大,其對(duì)應(yīng)的RSD數(shù)值都小于1,相對(duì)于傳統(tǒng)凝膠色譜5%左右的RSD有較大提升[18]。由此可見(jiàn)該方法測(cè)試木質(zhì)素磺酸鹽具有很好的重現(xiàn)性。

表 4 木質(zhì)素磺酸鹽平均相對(duì)分子質(zhì)量及其分布指數(shù)的重現(xiàn)性

2.3.3木質(zhì)素磺酸鹽的膜分離產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布

采用1.3節(jié)所述的超濾組分的制備技術(shù)對(duì)木質(zhì)素磺酸鹽進(jìn)行膜分離,膜分離時(shí)的溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,實(shí)驗(yàn)分別截留了3個(gè)分離組分,分別為相對(duì)分子質(zhì)量在3×104Da以上組分、相對(duì)分子質(zhì)量為1×104～3×104Da的組分和相對(duì)分子質(zhì)量在1×104Da以下的組分。收集器中截留液的顏色隨截留相對(duì)分子質(zhì)量的降低逐漸變淺,采用APC分析了木質(zhì)素磺酸鹽膜分離的3個(gè)截留樣品的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布,結(jié)果見(jiàn)圖3和表5。從圖3中可以看出,APC對(duì)分級(jí)分離產(chǎn)物的測(cè)試具有很高的分辨率,3個(gè)組分的Mn分別為40 410、12 208和1 516 Da,其分散指數(shù)分別為2.09、2.80和2.51。APC分離分析結(jié)果表明,采用超濾方法分離木質(zhì)素磺酸鹽獲得了很好的效果,APC方法是一種指導(dǎo)和優(yōu)化膜分離技術(shù)的有效表征手段。

圖 3 超濾膜分離后的木質(zhì)素磺酸鹽各組分的APC譜圖

表 5 超濾膜分離后的木質(zhì)素磺酸鹽的平均相對(duì)分子質(zhì)量及其分布指數(shù)

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)考察了流動(dòng)相pH值、離子強(qiáng)度等測(cè)試條件對(duì)超高效聚合物色譜分析水溶性高分子相對(duì)分子質(zhì)量的影響。在此基礎(chǔ)上,初步研究了影響APC分析結(jié)果的離子排斥和吸附等非體積排阻效應(yīng)機(jī)制,建立了精細(xì)相對(duì)分子質(zhì)量結(jié)構(gòu)信息的木質(zhì)素磺酸鹽的APC測(cè)試方法。采用該方法表征超濾分級(jí)分離的木質(zhì)素磺酸鹽組分,證明了超濾法對(duì)木質(zhì)素磺酸鹽實(shí)現(xiàn)了高效分離,為后期分級(jí)分離產(chǎn)物的高效應(yīng)用研究建立了基礎(chǔ)。本研究將促進(jìn)復(fù)雜天然高分子木質(zhì)素磺酸鹽的精細(xì)化應(yīng)用(分級(jí)分離以及解聚產(chǎn)物等)研究,也為其他天然高分子產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)性能研究提供了新的方法路徑。