李萍 吉薇薇 彭昕

[摘要] 目的 研究三葉青提取物對α-異硫氰酸萘酯（ANIT）所致肝損傷小鼠的保護(hù)作用。 方法 2017年1月～2018年2月選擇60只小鼠并隨機分為6組，分別為對照組、聯(lián)苯雙酯陽性藥物組、模型組、三葉青提取物低、中、高劑量組[（1.0、2.0、4.0）g/kg]。采用灌胃ANIT的方式復(fù)制急性黃疸型肝炎模型，造模48 h后測其血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α的含量；檢測肝組織勻漿中SOD、MDA、GSH-Px的水平。 結(jié)果 三葉青提取物各劑量組均可顯著降低TBIL和TNF-α水平（P<0.05），中、高劑量組可以降低血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量（P<0.05），各劑量組均顯著降低MDA含量，中、高劑量組可顯著提高SOD活性（P<0.05），而GSH-Px水平無顯著變化。結(jié)論 三葉青提取物對ANIT所致小鼠肝損傷有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與減輕炎癥因子產(chǎn)生、促進(jìn)總膽紅素的代謝、降低脂質(zhì)過氧化程度有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 三葉青；ANIT；肝損傷；抗氧化

[中圖分類號] R969.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）30-0032-04

[Abstract] Objective To study the protective effect of trifolium extract on liver injury induced by α-isothiocyanatoacetate （ANIT） in mice. Methods 60 mice from January 2017 to February 2018 were randomly divided into 6 groups， including control group， bifendate positive drugs group， model group， trifolium extract low， medium and high dose groups[（1.0， 2.0， 4.0） g/kg]. The model of acute jaundice hepatitis was reproduced by intragastric administration of ANIT. The levels of ALT， AST， TBA， TBIL， and TNF-α in serum were determined 48 h after modeling. The levels of SOD， MDA， and GSH-Px in liver homogenate were measured. Results The levels of TBIL and TNF-α were significantly decreased in each dose group（P<0.05）. The levels of ALT， AST， TBA， TBIL and TNF-α in serum were decreased in medium and high dose groups（P<0.05）. Each dose group significantly decreased the MDA content. The medium and high dose group could significantly increase SOD activity（P<0.05），while GSH-Px levels did not change significantly. Conclusion Trifolium extract has a protective effect on liver injury induced by ANIT in mice. Its protective effect may be related to the reduction of inflammatory factors， promotion of the total bilirubin metabolism and reduction of the lipid peroxidation degree.

[Key words] Trifolium； ANIT； Liver injury； Antioxidant

急性黃疸型肝炎是各種誘因?qū)е赂渭?xì)胞腫脹、變性，從而引起膽紅素的排泄障礙，進(jìn)而形成黃疸的肝臟損傷疾病，除了皮膚黃染、低熱、食欲不振、尿黃等表征外，還伴有總膽紅素、多種轉(zhuǎn)氨酶等臨床生化指標(biāo)的升高[1]。中醫(yī)對黃疸型肝炎的治療具有悠久的歷史，多以清熱解毒、利濕退黃、活血化瘀、疏利肝膽論治[2]，能夠一定程度地緩解患者細(xì)膽管的淤膽和膽栓的形成，從而清除患者體內(nèi)的集聚膽汁[3]。

三葉青是我國特有珍稀植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）的塊根，具有清熱解毒、防癌護(hù)肝等多種功效，常用于高熱驚厥、肝炎、風(fēng)濕、肺炎、癰疔瘡癤等癥[4]。有研究報道，三葉青具有良好的保肝降酶及抗肝纖維化作用[5]，三葉青多糖對CCl4所致的急性肝損傷具有量效依賴的阻抗作用[6]，前期本課題組的研究表明，三葉青提取物能誘導(dǎo)人肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞凋亡[7]。本文利用α-異硫氰酸萘酯（ANIT）所致小鼠肝損傷模型，探討其對急性黃疸型肝炎的潛在功效，為其臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2017年1月～2018年2月期間，60只昆明種雄性SPF級小鼠，體重（18±3）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。每日12 h照明，保持環(huán)境溫、濕度分別為（25±2）℃、（55±5）%。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 異硫氰酸萘酯（ANIT）購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸購自浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠；膽汁酸（TBA）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）檢測試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD），考馬斯亮藍(lán)試劑盒、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒均購自寧波航景生物科技有限公司；腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購自碧云天生物科技公司。

1.2.2 藥品制備 稱取干燥三葉青藥材粉末10 g，用200 mL 80%乙醇加熱回流提取3次，每次45 min，合并提取液，減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至50 mL，小鼠灌胃量20、10、5 mL/kg則分別制得高、中、低劑量（按生藥計為4.0、2.0、1.0 g/kg）。給藥劑量參考成人臨床常規(guī)用量確定。

1.2.3 動物分組與給藥 60只小鼠按每組10只隨機分為6組，分別為對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯陽性藥物組，低、中、高劑量（1.0、2.0、4.0 g/kg）組。連續(xù)給藥10 d，對照組和模型組灌胃生理鹽水，陽性藥物組給予聯(lián)苯雙酯溶液（0.15 g/kg），低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)濃度的提取物，第8天給藥1 h后造模，對照組給予花生油灌胃15 mL/kg，其他各組小鼠灌胃100 mg/kg ANIT（用花生油75 mL溶解0.5 g ANIT制得），灌胃前、后分別禁食16 h、4 h。

1.3 檢測指標(biāo)測定

造模48 h后小鼠眼靜脈叢取血，采血前禁食12 h，全血在4℃，5000 r/min，離心5 min，取上層血清置4℃貯存?zhèn)溆?，檢測血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量。取血后處死小鼠并迅速分離肝臟，取相同部位的肝組織，經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色，顯微鏡下比較各組病理組織的形態(tài)學(xué)變化差異；并采用比色法檢測肝組織勻漿中SOD，MDA、GSH-Px的活性/含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s）表示，多組間采用One-way ANOVA方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三葉青提取物對ANIT致肝臟病理組織學(xué)變化的影響

如封三圖2所示，HE染色可見正常組小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，肝索及肝血竇排列規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，大量肝細(xì)胞擴張并含有大量紅細(xì)胞游積，脂滴空泡，可見點狀壞死。聯(lián)苯雙酯陽性藥組和各給藥組均能不同程度地減輕肝臟受損程度。肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝竇結(jié)構(gòu)較清晰，肝索基本呈放射狀排布，鏡下雖可見少量炎性細(xì)胞浸潤，但與模型組相比有明顯改善。

2.2 三葉青提取物對肝損傷小鼠血清ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量的影響

模型組小鼠肝功能和TNF-α 5項指標(biāo)的水平均較正常對照組顯著增加（P<0.05），表明造模成功。聯(lián)苯雙酯陽性藥物組ALT、TBIL、TNF-α 3項指標(biāo)水平較模型組均顯著下降（P<0.05），AST、TBA水平無顯著變化；低劑量組（1 g/kg）的TBIL和TNF-α水平顯著下降；中、高劑量組（2、4 g/kg）均可使血清ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α水平顯著下降（P<0.05）。見表1。

2.3 三葉青提取物對ANIT致肝損傷小鼠肝勻漿SOD、MDA、GSH-Px活性的影響

從表2結(jié)果可知，模型組SOD、GSH-Px 2項指標(biāo)的活性均較對照組顯著降低（P<0.05），而MDA含量較對照組顯著升高（P<0.05）。聯(lián)苯雙酯陽性藥物組SOD、GSH-Px 2項指標(biāo)的活性均較模型組顯著升高（P<0.05），而MDA含量較模型組顯著下降（P<0.05）；三葉青高劑量組（4 g/kg）可顯著提高SOD活性，并顯著降低MDA含量，低、中劑量組（1、2 g/kg）均可顯著降低MDA含量（P<0.05），GSH-Px 水平無顯著變化。見表2。

3 討論

異硫氰酸萘酯（ANIT）致小鼠肝損傷是常用的急性黃疸型肝炎模型。ANIT進(jìn)入體內(nèi)后，先發(fā)生膽管周圍微環(huán)境的改變，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞受刺激后觸發(fā)免疫作用[8]，肝中出現(xiàn)上皮增生，并損傷膽管上皮細(xì)胞，使膽汁淤積、膽管阻塞，引起肝內(nèi)膽管增生及周圍炎癥，從而導(dǎo)致高膽紅素血癥和膽汁分泌減少，最終產(chǎn)生肝臟毒性[9]。

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）是主要分布在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性酶，肝臟受損后肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)氨酶便釋放入血，血清中ALT和AST水平高低常作為判定肝損傷程度的重要指標(biāo)。丙二醛（MDA）是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的代謝終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，其含量可反映體內(nèi)氧自由基生成量及活性，從而間接反映機體和細(xì)胞的受損程度[10]。過多的活性氧攻擊肝細(xì)胞膜而致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時耗竭肝細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶[11]，SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）均是機體主要的氧自由基清除酶，是肝、肺等多種組織重要的抗氧化防御因子[12]，能夠清除活性氧自由基及其誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。由肝巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α是一種重要的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子[13]，通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和其他炎癥因子的生成，引起肝小葉受損，ALT和AST水平明顯升高，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤，增加氧自由基的釋放，還可誘導(dǎo)IL-1、IL-8等細(xì)胞因子釋放[14]，破壞機體的免疫平衡，是參與各種肝臟疾病發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因子[15，16]。

黃疸型肝炎病程長，部分病例退黃較難。病因從西醫(yī)角度多為膽紅素生成過多、肝細(xì)胞功能較低、膽汁瘀積等，多采用腎上腺皮質(zhì)激素等治療，而長期應(yīng)用激素會發(fā)生多種嚴(yán)重的副作用，且臨床應(yīng)用的禁忌證較多。中醫(yī)角度認(rèn)為黃疸型肝炎為“濕、熱、毒、瘀”引起的渾濁阻滯，肝膽功能失調(diào)引起的肝膽病癥。近年來中醫(yī)藥在治療黃疸型肝炎方面的臨床報道日趨增多，主要涉及清熱、祛濕、瀉下、補虛、理氣、解表6大類[17]，以清熱解毒，利濕化痰，退黃保肝之法為主[18]。如茵陳蒿湯、茵梔黃顆粒、酢漿草白茅根煎劑等[19]，中醫(yī)治療黃疸雖有明顯療效和特色，然而目前的研究多為臨床療效觀察，對藥物作用機制的研究尚不清晰。三葉青具有清熱解毒、祛濕化痰、活血止痛等傳統(tǒng)功效，民間用于抗小兒高熱、黃疸型肝炎、腦膜炎等[20]，可充分發(fā)揮其調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、促進(jìn)肝臟修復(fù)的作用，然而其作用機制尚缺乏現(xiàn)代藥理學(xué)實驗研究。從本研究結(jié)果可知，三葉青提取物各劑量組均可顯著降低TBIL和TNF-α水平（P<0.05），中、高劑量組可以降低血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量（P<0.05），并且降低水平存在一定的量效關(guān)系。表明其可通過減輕炎癥因子產(chǎn)生，促進(jìn)總膽紅素的代謝，減少膽汁酸（TBA）的積累而減輕肝細(xì)胞受損和壞死的程度[21]。另一方面，三葉青各劑量組均顯著降低MDA含量，中、高劑量組可顯著提高SOD活性，而GSH-Px水平無顯著變化，表明其可以通過提高肝細(xì)胞中抗氧化酶活性，抑制肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化等來改善肝損傷情況。

本研究結(jié)果為三葉青保肝作用的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了相關(guān)實驗依據(jù)，綜合運用中西醫(yī)不同的退黃措施并促使其互為補充以提高療效的臨床研究，有待更進(jìn)一步的深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李妍.復(fù)方甘草酸苷注射液與前列地爾聯(lián)合治療急性黃疸型肝炎的臨床效果研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2017，55（13）：102-104.

[2] 倪新元.清熱利濕聯(lián)合活血化瘀法治療急性黃疸型肝炎臨床觀察[J].中國中醫(yī)急癥，2013，22（3）：489-490.

[3] 饒雅琪，張麗，曾金祥，等.長毛風(fēng)毛菊醇提物對ANIT所致小鼠肝損傷的保肝作用研究[J].中國新藥雜志，2017， 26（13）：1566-1571.

[4] 彭昕，吉慶勇，張煜炯，等.珍稀藥用植物三葉青種質(zhì)資源研究現(xiàn)狀[J].中國現(xiàn)代中藥，2016，8：1088-1092.

[5] 張同遠(yuǎn)，倪荷芳.三葉青抗慢性肝損傷實驗研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，24（1）：37-39.

[6] 馬丹丹，李偉平，馬哲龍，等.三葉青多糖抗肝損傷作用的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41（1）：33-36.

[7] 王靜，彭昕.三葉青提取物誘導(dǎo)人肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞凋亡的研究[J].中國藥師，2015，18（7）：1081-1085.

[8] 蘇峰，郝少君，孫建華，等.復(fù)方黃櫨口服液對小鼠黃疸型肝炎模型血清中指標(biāo)的影響[J].實用藥物與臨床，2016， 19（11）：1325-1328.

[9] 蘇峰，郝少君，黎丹東，等.復(fù)方黃櫨口服液對小鼠黃疸型肝炎模型肝臟中指標(biāo)的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017， 35（8）：2176-2178.

[10] 黃約諾，黃立搜，徐鵬，等.參附注射液對膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（6）：26-33.

[11] 馬燕花，楊少軍，師霞，等.慈菇消脂丸對非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂毒性及氧化應(yīng)激的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2018，25（1）：48-53.

[12] 肖日傳，羅光明，董麗華，等.基于黃疸模型的梔子根與梔子果實保肝作用探討[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2018， 24（7）：102-107.

[13] 何蓓暉，項柏康，蔡丹莉，等.三七對酒精性脂肪肝大鼠血清TNF-α、Leptin水平的影響[J].浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，29（3）：124-127.

[14] 許靜，李兆翌，施軍平，等.復(fù)方楂金顆粒防治非酒精性脂肪性肝炎的藥效學(xué)及機制研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（12）：2939-2943.

[15] 馬艷霞，吳勉華，姜澤群，等.山茱萸環(huán)烯醚萜苷對D-GalN/TNF-α損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用研究[J].中國藥理學(xué)通報，2018，34（1）：118-122.

[16] 潘洪帥，郭亞民，朱海宏.高原低氧環(huán)境與大鼠SAP肝損傷中TNF-α的相關(guān)性[J].西部醫(yī)學(xué)，2018，30（2）：165-173.

[17] 單思，聶鵬，席惠芳，等.中藥治療黃疸研究進(jìn)展[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（11）：2486-2489.

[18] 姜超，劉家云，翟兢，等.白藜蘆醇退黃保肝作用及其與膽汁酸排泄的相關(guān)性研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，35（10）：1372-1376.

[19] 郭其裕，陳建能，鄭瑞丹.中醫(yī)藥治療黃疸型肝炎的臨床研究現(xiàn)狀[J].臨床肝膽病雜志，2017，33（5）：833-837.

[20] 楊雄志.中藥三葉青的藥理作用與臨床應(yīng)用[J].吉林中醫(yī)藥，2009，29（6）：517-518.

[21] 饒雅琪，王娟，曾金祥，等.禾葉風(fēng)毛菊醇提物對ANIT所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2017， 28（7）：1622-1625.

（收稿日期：2018-03-30）