施凱 馮月娟 王建峰 王燦燦 郁東偉 陳學(xué)遠

[摘要] 目的 探討microRNA-149（miR-149）在順鉑耐藥A549細胞（A549/DDP）中的表達規(guī)律及作用機制。 方法 生物信息學(xué)方法分析順鉑耐藥A549細胞中的microRNA表達變化。體外培養(yǎng)A549細胞并誘導(dǎo)對順鉑耐藥的A549/DDP細胞系，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-149在兩種細胞系中的表達差異。CCK-8試驗及流式細胞術(shù)檢測單純miR-149 過表達以及miR-149和ABCC1同時過表達對細胞順鉑敏感性的影響。qRT-PCR及Western blot檢測A549及A549/DDP細胞中ABCC1的表達差異，雙熒光素酶報告試驗檢測miR-149以ABCC1之間的靶向關(guān)系，并利用qRT-PCR及Western blot加以證實。 結(jié)果 A549/DDP細胞中的miR-149 表達較低，與A549細胞相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.65，P<0.05）。miR-149過表達可以降低順鉑處理后A549/DDP細胞的活力但增加其凋亡率，與陰性轉(zhuǎn)染對照細胞相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。與A549細胞相比ABCC1在A549/DDP細胞中存在mRNA及蛋白水平的高表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.44、5.14，P均<0.05）。過表達miR-149可以降低A549/DDP細胞中ABCC1的mRNA及蛋白水平，與陰性轉(zhuǎn)染對照細胞相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.14、-4.54，P<0.05）。雙熒光報告酶分析顯示miR-149可直接與ABCC1 mRNA的3UTR結(jié)合。miR-149與ABCC1同時過表達的A549/DDP細胞與單純miR-149過表達的細胞相比，順鉑處理后細胞活力增加，凋亡減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。 結(jié)論 miR-149表達不足可能引起A549細胞對順鉑的耐藥，該機制與miR-149對ABCC1的抑制作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 非小細胞肺癌；microRNA-149；ABCC1；順鉑；耐藥性

[中圖分類號] R734.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）30-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the expression principle and mechanism of microRNA-149（miR-149） in cisplatin-resistant A549 cells （A549/DDP）. Methods Bioinformatics methods were used to analyze microRNA expression changes in cisplatin-resistant A549 cells. A549 cells were cultured in vitro and induced to cisplatin-resistant A549/DDP cell line. Real-time fluorescence quantification PCR（qRT-PCR） was used to detect the differences in the expression of miR-149 in both cell lines. CCK-8 assay and flow cytometry were used to detect the effect of miR-149 overexpression alone and the simultaneous overexpression of miR-149 and ABCC1 on cell cisplatin sensitivity. qRT-PCR and Western blot were used to detect the difference of ABCC1 expression in A549 and A549/DDP cells. Dual luciferase reporter assay was used to detect the targeting relationship between miR-149 and ABCC1， which was confirmed by qRT-PCR and Western blot. Results The expression of miR-149 was lower in A549/DDP cells. The difference was statistically significant compared to A549 cells（t=-4.65， P<0.05）. Overexpression of miR-149 could reduce the viability of A549/DDP cells after cisplatin treatment but increase its apoptosis rate. The difference was statistically significant compared to the negative transfected control cells（P<0.05）. Compared with A549 cells， ABCC1 had high expression of mRNA and protein in A549/DDP cells， and the difference was statistically significant（t=8.44 and 5.14， P<0.05）. Overexpression of miR-149 could decrease the mRNA and protein levels of ABCC1 in A549/DDP cells. The difference was statistically significant compared to the negative transfected control cells（t=-3.14 and -4.54， P<0.05）. Dual luciferase reporter assay showed that miR-149 bound directly to the 3' UTR of ABCC1 mRNA. Compared with cells overexpressing miR-149 alone， combined overexpression of miR-149 and ABCC1 in A549/DDP cells showed increased cell viability and decreased apoptosis after cisplatin treatment， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Insufficient expression of miR-149 may cause resistance of cisplatin to A549 cells. This mechanism is related to the inhibition of ABCC1 by miR-149.

[Key words] Non-small cell lung cancer； microRNA-149； ABCC1； Cisplatin； Drug resistance

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是常見的肺癌分型，約占全部病例的80%，且患者預(yù)后較差[1]。順鉑是NSCLC治療的一線化療藥物，但臨床應(yīng)用過程中的順鉑耐藥現(xiàn)象消弱了治療效果，制約了化療方案的開展[2]。順鉑耐藥現(xiàn)象的發(fā)生與多種原因有關(guān)，如P-糖蛋白的異常、患者基因突變、藥物轉(zhuǎn)運載體蛋白的結(jié)構(gòu)功能缺陷、腫瘤干細胞的行為異常以及腫瘤微環(huán)境的異常等[3，4]。對順鉑耐藥分子機制的研究有助于臨床化療效果的改進和療效監(jiān)測。

microRNA是一類非編碼短鏈RNA，長度在21～26個核苷酸左右。哺乳動物中，microRNA可通過與靶基因mRNA 3端非翻譯區(qū)（3-UTR）的互補結(jié)合，抑制靶基因mRNA的翻譯，從而實現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[5，6]。研究證實microRNA的異常不但與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，也與腫瘤對化療的敏感性或耐藥性的發(fā)生有關(guān)。有研究指出，microRNA-149（miR-149）的下調(diào)與結(jié)腸癌對5-氟尿嘧啶的耐藥性有關(guān)，miR-149可以通過對FOXM1的調(diào)節(jié)增加結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[7]。但關(guān)于miR-149是否參與NSCLC對順鉑的耐藥及其機制還有待研究。ABCC1是ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族的成員，一般認為過量的ABCC1表達會引起腫瘤細胞的耐藥，特別是多藥耐藥[8，9]。因此本研究探討了miR-149與NSCLC對順鉑耐藥的關(guān)系，并假設(shè)此過程中其以ABCC1為靶點，通過對ABCC1的調(diào)控來實現(xiàn)作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清（美國GIBCO公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；順鉑（美國sigma-aldaich公司）；CCK-8細胞活力分析試劑盒（美國sigma-aldaich公司）；Trizol試劑（美國thermofisher公司）；Prime script RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物有限公司）；SYBR premix EX taq實時熒光定量試劑盒（大連寶生物有限公司）；GoScript Reverse Transcription反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司）；雙熒光素酶報告分析試劑盒（美國Promega公司）；Annexin V-FITC和碘化丙啶（美國sigma-aldaich公司）；小鼠抗人ABCC1多克隆抗體、小鼠抗人多克隆GAPDH及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠lgG二抗（美國Santa-Cruz公司）；ECL超敏發(fā)光試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 生物信息學(xué)分析

檢索Gene Expressionomnibus（GEO）公共基因數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)，分析miR-149在順鉑耐藥非小細胞肺癌中的表達差異。使用Target scan及miRanda數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-149的靶基因。

1.3 細胞培養(yǎng)

人類肺腺癌A549細胞系購自中國科學(xué)院上海細胞研究所。通過將A549細胞暴露于逐漸增高的濃度的順鉑中可獲得對順鉑耐藥的A549細胞株（最大順鉑暴露濃度為1 μg/mL），該細胞株命名為A549/DDP細胞。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。為維持A549/DDP細胞的耐藥性，培養(yǎng)液中需加入0.5 μg/mL的順鉑。進行其他試驗前1周，A549/DDP需培養(yǎng)于無順鉑的培養(yǎng)液中，以避免藥物干擾。

1.4 細胞活力分析

細胞活力分析采用CCK-8細胞活力分析試劑盒。將A549細胞和A549/DDP細胞以4000個/孔的密度種植于96孔板中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，加入不同濃度的順鉑（0～20 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK8試劑，溫箱孵育1 h后使用酶標(biāo)儀（Biotech Elx800）測量450 nm處吸光度。

1.5 熒光實時定量PCR

使用Trizol試劑提取A549細胞及A549/DDP細胞的總RNA樣本。為檢測樣品中miR-149的水平，使用Prime script RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄，獲取的cDNA使用SYBR premix EX Taq試劑盒進行擴增定量。反應(yīng)體系和條件嚴格按照廠商說明書進行設(shè)定，內(nèi)參基因使用SNORD-48。為檢測ABCC1 mRNA水平，使用GoScript Reverse Transcription反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，接著使用GoTaqRqPCR 試劑盒進行擴增定量，反應(yīng)體系和條件按照說明書提供的方案進行。使用GAPDH作為內(nèi)參，miR-149和ABCC1的相對表達水平通過2-△△CT計算，△CT=CT目標(biāo)-CT內(nèi)參。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染

通過向A549/DDP轉(zhuǎn)染miR-149 mimic以提高細胞內(nèi)的miR-149水平。將細胞以3×105/孔的密度種植于6孔板，當(dāng)細胞匯合度到達70%時，進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine RNAiMax試劑，轉(zhuǎn)染混合物的配置及用量參考廠商提供的說明書。轉(zhuǎn)染All star 無關(guān)序列作為mimic陰性對照（mimic NC）。通過轉(zhuǎn)染PcDNA3.0-ABCC1真核表達質(zhì)粒提高A549/DDP細胞以實現(xiàn)ABCC1的過表達，轉(zhuǎn)染試劑采用lipofectamine 2000，以PcDNA3.0空質(zhì)粒為陰性對照。轉(zhuǎn)染48 h后，使用qRT-PCR及Western blot對轉(zhuǎn)染效果進行驗證，選擇轉(zhuǎn)染有效的細胞進行隨后試驗。CCK-8試驗分析轉(zhuǎn)染后細胞對不同濃度順鉑處理的敏感性變化。

1.7 雙熒光素酶報告試驗

采用雙熒光素酶報告試驗驗證miR-149與ABCC1的靶向關(guān)系。分別構(gòu)建ABCC1 3-UTR野生型及突變型熒光素酶報告質(zhì)粒，分別命名為pMIR-ABCC1-wild與pMIR-ABCC1-mut。對A549細胞實施報告質(zhì)粒與miR-149 mimic的共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染組合為miR-149 mimic+pMIR-ABCC1-wild、mimic 陰性對照+pMIR-ABCC1-wild、miR-149 mimic+pMIR-ABCC1-mut以及mimic 陰性對照+pMIR-ABCC1-mut。將轉(zhuǎn)染后的各組細胞以1×104/孔的密度種植于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，隨后每孔加入100 μL裂解液，收集裂解后的上清液，取出部分上清液加入40 μL螢火蟲熒光素底物，混合均勻15 s 后測定熒光強度。剩余上清液加入40 μL海腎熒光素酶底物，混合均勻后測定熒光強度，計算螢火蟲熒光素強度值與海腎熒光素強度值的比值。

1.8 凋亡分析

細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理48 h后，以3×105/孔的密度種植于6孔板，待細胞貼壁后，加入15 μg/mL順鉑，處理48 h后收集細胞，70%預(yù)冷酒精固定12 h，隨后使用Annexin V-FITC和碘化丙啶對細胞進行染色，避光孵育半小時，使用流式細胞儀（GuavaR easyCyte system）分析各組細胞凋亡情況，計算凋亡率。

1.9 Western blot分析

使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白，BCA試劑盒測定樣本濃度后，以每孔50 μg的濃度上樣。電泳采用10%聚丙烯酰胺凝膠，電壓為100 V。電泳完成后，90 V電壓進行轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜完成后的PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。隨后分別使用1：500的小鼠抗人ABCC1多克隆抗體、1：1000小鼠抗人GAPDH多克隆抗體進行一抗孵育，時間12 h，溫度4℃。一抗孵育完成后，使用PBST洗滌3次，除去多余抗體。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（1：2000）室溫繼續(xù)孵育1～2 h，ECL超敏發(fā)光試劑盒顯色并分析條帶。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS19.0軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，兩組間均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-149在順鉑耐藥A549細胞中的表達

編號GSE85603的芯片數(shù)據(jù)集顯示順鉑耐藥A549細胞中的miR-149表達水平較低，與順鉑敏感的A549細胞相比降低了2.11倍，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。體外實驗顯示，miR-149在A549/DDP細胞中的相對表達水平為（0.51±0.03），與A549細胞相比（1.00±0.02）顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.65，P<0.05）。

2.2 上調(diào)miR-149可增加A549/DDP細胞對順鉑的敏感性

CCK-8試驗的結(jié)果顯示，通過轉(zhuǎn)染miR-149 mimic上調(diào)miRNA-149的水平，并經(jīng)不同濃度順鉑處理后，A549/DDP細胞的活力明顯低于陰性轉(zhuǎn)染對照細胞（mimic NC），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。凋亡分析顯示，經(jīng)15 μg/mL順鉑處理48 h后，上調(diào)miR-149后A549/DDP細胞的凋亡率為（30.12±4.21）%，轉(zhuǎn)染mimic NC的A549/DDP細胞凋亡率為（10.21±2.45）%，兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.25，P<0.05）。

2.3 miR-149與ABCC1的靶向關(guān)系

qRT-PCR結(jié)果顯示，A549/DDP細胞中ABCC1 mRNA的相對水平為（4.31±0.52），而A549細胞中的ABCC1 mRNA的相對水平為（1.00±0.03），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.44，P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示（圖1），A549/DDP細胞同時存在ABCC1蛋白水平的高表達（t=5.14，P<0.05）。上調(diào)miR-149 后，A549/DDP細胞內(nèi)ABCC1的mRNA相對水平降至（0.61±0.24），而陰性轉(zhuǎn)染對照細胞的ABCC1 mRNA相對水平為（1.00±0.20），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.14，P<0.05），同時ABCC1蛋白表達也有所降低（t=-4.54，P<0.05）（圖2）。

通過Target scan及miRanda數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)預(yù)測顯示，ABCC1可能為miR-149的靶基因。雙熒光素酶報告試驗顯示（表2），共轉(zhuǎn)染miR-149 mimic+pMIR-ABCC1-wild的細胞內(nèi)相對熒光強度低于共轉(zhuǎn)染miR-149 mimic+pMIR-ABCC1-mut的細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示miR-149可以結(jié)合ABCC1的3-UTR區(qū)域，可以ABCC1為直接靶基因。當(dāng)轉(zhuǎn)染PcDNA3.0-ABCC1表達質(zhì)粒實現(xiàn)A549/DDP細胞中的ABCC1的過表達后，可見miR-149提高A549/DDP細胞順鉑敏感性的作用被抑制。表現(xiàn)為與僅上調(diào)miR-149的A549/DDP細胞相比，同時過表達ABCC1的細胞在順鉑處理后的活力增加（表3），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。另一方面，僅上調(diào)miR-149的A549/DDP細胞的凋亡率為（35.41±5.21）%，同時過表達ABCC1的細胞凋亡率降至（20.11±3.98）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.62，P<0.05）。

3 討論

盡管基于鉑類藥物的化療方案已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于NSCLC的治療，但其臨床療效仍然受限于原發(fā)或繼發(fā)性的藥物耐受[2]。因此充分掌握NSCLC對鉑類藥物耐受的機制，有助于臨床治療方案的制定和改進，從而提高治療效果。關(guān)于NSCLC對順鉑耐藥的機制，不少研究已經(jīng)有所報道，主要有以下幾個經(jīng)典的機制：（1）細胞表面膜蛋白異常，導(dǎo)致藥物攝取減少或泵出增多；（2）DNA修復(fù)功能過強，凋亡減少；（3）細胞代謝增強，藥物被代謝酶過多清除[10，11]。近期研究發(fā)現(xiàn)，獲得性的順鉑耐藥與microRNA的失調(diào)有關(guān)[12-15]。如Su等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-135b在對順鉑耐藥的肺癌細胞系中存在顯著低表達，恢復(fù)其水平后，該細胞系對順鉑的敏感性提高。其機制可能為miR-135b能夠降低FZD1基因的表達，后者表達的產(chǎn)物為Wnt通過的受體，F(xiàn)ZD1過度表達可以引起腫瘤細胞的耐藥性。還有研究指出，一些microRNA的過表達可以誘導(dǎo)NSCLC對順鉑的耐藥性。如miR-379會導(dǎo)致其靶基因EIF4G2的表達抑制，EIF4G2具有抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)凋亡的功能，因此miR-379的過表達引起EIF4G2的不足，從而導(dǎo)致NSCLC細胞對順鉑的敏感性降低[17]。關(guān)于microRNA與NSCLC順鉑耐藥性的研究近期較為熱門，涉及microRNA及其相關(guān)靶基因各不相同。但關(guān)于miR-149與NSCLC順鉑耐藥的研究還較少，因此本研究將焦點集中在miR-149。

研究表明，miR-149具有抑癌作用。有研究證實其可抑制結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，在乳腺癌中也能發(fā)揮抑制侵襲的作用[7，18]。在腦膠質(zhì)瘤中miR-149可以抑制腫瘤細胞的增殖[19]。更重要的是，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-149可以增加結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[7]，因此基于miR-149在腫瘤中的抑癌作用及涉及耐藥性的相關(guān)研究，本研究推測，miR-149可能與NSCLC細胞對順鉑耐藥有關(guān)。首先我們分析了公共數(shù)據(jù)庫中的已發(fā)表數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示miR-149在A549/DDP中存在較低的表達。本研究也通過qRT-PCR驗證了miR-149在順鉑耐藥NSCLC細胞株 A549/DDP細胞中的表達，結(jié)果顯示與非順鉑耐藥的A549細胞株相比，miR-149在耐藥株中存在低表達。通過轉(zhuǎn)染miR-149 mimic提高其在A549/DDP細胞中的表達后，耐藥株對順鉑的敏感性得到了提高，表現(xiàn)為增殖抑制增加，凋亡增加。另一方面，我們也發(fā)現(xiàn)ABCC1在A549/DDP細胞中存在高表達，生物信息學(xué)分析也顯示，ABCC1為miR-149的潛在靶基因。因此，我們進一步推測miR-149可能通過調(diào)控ABCC1來實現(xiàn)對NSCLC細胞順鉑耐藥性的影響。之所以關(guān)注ABCC1，是因為已經(jīng)有研究指出，ABCC1與腫瘤細胞的耐藥密切相關(guān)，特別是與多重耐藥的發(fā)生密不可分。如有研究發(fā)現(xiàn)ABCC1的高表達能引起肺癌化療敏感性的降低，其基因多態(tài)性可以作為肺癌治療敏感性的指標(biāo)。Pei等[20]證實，在小細胞肺癌中，ABCC1的過表達意味著患者對化療的敏感性較差，提示不良預(yù)后。Liu等[21]在小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn)，ABCC1可受microRNA-7的直接靶向調(diào)節(jié)，microRNA-7可以抑制ABCC1的表達從而提高小細胞肺癌對多種化療藥物的敏感性。還有研究發(fā)現(xiàn)ABCC1同時受microRNA-185的調(diào)控，從而參與NSCLC對順鉑的耐藥調(diào)控。本研究證實A549/DDP細胞株中存在ABCC1的高表達，提示其參與順鉑的耐藥，與既往研究一致。為明確其與miR-149的靶向關(guān)系，本研究設(shè)計了雙熒光素酶報告試驗，結(jié)果提示，在A549/DDP細胞中，miR-149可直接以ABCC1為靶點。增加miR-149的表達后，ABCC1的mRNA和蛋白水平均降低。更重要的是，當(dāng)使用ABCC1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A539/DDP后，即使提高miR-149水平，也無法增加細胞對順鉑的敏感性。該結(jié)果提示miR-149 對順鉑耐藥的NSCLC敏感性的提高有賴于對ABCC1的靶向調(diào)節(jié)。本研究未使用動物實驗驗證結(jié)果，這是本研究的局限性，有待于在進一步研究中解決。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-149可通過靶向抑制ABCC1的水平增加NSCLC細胞對順鉑的敏感性。設(shè)計可改變miR-149水平的靶向方案，具有提高NSCLC患者順鉑治療療效的潛力。同時，檢測miR-149可能成為預(yù)測患者化療敏感性的指標(biāo)。

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（收稿日期：2018-04-16）