頭孢氨芐水解物的鎳/鋅單核配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性

楊 晨 王國平

（浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027）

0 引 言

頭孢菌素是一類重要的抗感染藥物，具有抗菌作用強(qiáng)、耐水解、高效、毒性小等優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床應(yīng)用最廣的抗生素。頭孢氨芐作為目前臨床使用量較大的一種半合成、廣譜頭孢菌素[1]，能通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌活性。研究發(fā)現(xiàn)，許多藥物以金屬配合物的形式存在時擁有較好的可修飾的毒理學(xué)和藥理學(xué)特性[2]，甚至有明顯的抗腫瘤活性[3-6]。頭孢氨芐含有豐富的潛在供體原子，如側(cè)鏈氨基、羧基、β-內(nèi)酰胺和酰胺基團(tuán)，可有效地作為配位劑與金屬離子反應(yīng)形成穩(wěn)定的配合物[7]。近年來對頭孢菌素金屬配合物的配位行為和抗菌活性的研究較為廣泛，發(fā)現(xiàn)部分頭孢菌素與金屬配位后其抗菌活性可明顯增強(qiáng)[8-13]，但是對其抗腫瘤活性研究甚少。最近研究發(fā)現(xiàn)頭孢吡肟與金屬錳反應(yīng)形成配合物后可以有效抑制人類乳腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[14]，這說明該類配合物是一種潛在的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，可在未來應(yīng)用于癌癥治療。

因此，本文以頭孢氨芐為原料，選用鎳和鋅金屬離子在弱酸性條件下合成2個單核配合物[Ni（cepha）2]·6H2O （1）和[Zn（cepha）2]·6H2O （2）（cepha=cephalosporoate）。使用X射線單晶衍射分析確定其晶體結(jié)構(gòu)，并通過元素分析、紅外光譜、熱重分析和X射線粉末衍射分析對其進(jìn)行表征。在此基礎(chǔ)上通過MTT法研究配合物對人類肝癌細(xì)胞 （HepG-2）和人類乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的抗腫瘤活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

所用試劑均為市售分析純，頭孢氨芐購于Sigma且使用前未進(jìn)一步純化。紅外光譜采用KBr壓片法，在Nicolet FT-IR型紅外光譜儀上測試，測定范圍為4 000～400 cm-1；元素分析采用 Perkin-Elmer 1110元素分析儀測定配合物 C，H，N含量；熱重分析采用 MATTLER TGA/DSC1 1100儀，升溫速率為10℃·min-1，升溫至800℃；X射線粉末衍射采用 Ultima Ⅳ（Cu Kα 射線，λ=0.154 056 nm）測定，工作電壓為40 kV，工作電流為30 mA，X射線的入射角為 1°，在 5°～50°的 2θ角度范圍內(nèi)連續(xù)掃描，掃描速度為 10°·min-1。

1.2 配合物的合成

1.2.1 [Ni（cepha）2]·6H2O （1）的合成

準(zhǔn)確稱取 0.074 g（0.2 mmol）頭孢氨芐和 0.025 g（0.1 mmol）醋酸鎳，分別溶解于10 mL蒸餾水和5 mL甲醇溶液，并在攪拌狀態(tài)下將頭孢氨芐溶液逐滴加入到乙酸鎳溶液中得到混合溶液。將該混合溶液過濾，濾液置于室溫下?lián)]發(fā)溶劑。大約2周后，得到藍(lán)色的針狀晶體。產(chǎn)率：50.5%。元素分析按C32H48N6NiO16S2的計(jì)算值（%）：C 42.87,H 5.36,N 9.37;實(shí)驗(yàn)值（%）：C 42.18，H 5.50，N 9.46。

1.2.2 [Zn（cepha）2]·6H2O （2）的合成

準(zhǔn)確稱取 0.148 g（0.4 mmol）頭孢氨芐和 0.044 g（0.2 mmol）醋酸鋅，分別溶解于10 mL蒸餾水和10 mL甲醇溶液，并在攪拌狀態(tài)下將頭孢氨芐溶液逐滴加入到乙酸鋅溶液中得到混合溶液。將該混合溶液過濾，濾液置于室溫下?lián)]發(fā)溶劑。大約4周后，得到黃色的針狀晶體。產(chǎn)率：49.8%。元素分析按C32H48N6ZnO16S2的計(jì)算值（%）：C 42.55,H 5.32,N 9.31;理論值（%）：C 42.09，H 5.43，N 9.30。

Scheme 1 Syntheses of complexes 1 and 2

1.3 單晶結(jié)構(gòu)測定

選擇大小合適的單晶，粘在玻璃細(xì)纖維上，采用Oxford Gemini A Ultra型X射線單晶衍射儀，在293（2）K 用經(jīng)過石墨單色器的 Mo Kα 射線（λ=0.071 073 nm）作為入射光源，采用ω-2θ掃描方式收集衍射點(diǎn)數(shù)據(jù)，并對衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行了線性校正、經(jīng)驗(yàn)吸收校正、Lp校正。晶體結(jié)構(gòu)解析采用SHELXS-2016程序中的直接法解出[15]，其它非氫原子采用全矩陣最小二乘法和各項(xiàng)異性進(jìn)行修正。氫原子由Fourier法找出或用理論加氫。所有原子的散射因子均來源于國際晶體學(xué)表。配合物1和2的晶體學(xué)和精修參數(shù)見表1。

表1 配合物1和2的晶體學(xué)和精修參數(shù)Table 1 Crystal data and structure refinement for complexes 1 and 2

1.4 體外抗腫瘤活性測定

采用MTT比色法測定醋酸鎳、醋酸鋅、配體及配合物 1、2 對 MCF-7 （人類乳腺癌細(xì)胞）（24 h）和HepG-2（人類肝癌細(xì)胞）（12 h）的抑制增殖活性。測試方法同文獻(xiàn)[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 晶體結(jié)構(gòu)

配合物1和2的晶體結(jié)構(gòu)見圖1，部分重要的鍵長和鍵角以及氫鍵參數(shù)分別在表2和表3中列出。

配合物1為單核鎳配合物，屬于正交晶系，P22121空間群。中心鎳ギ離子的配位數(shù)為6，分別與來自2個配體分子的N原子和4個O原子配位。配位 鍵 Ni1-O1，Ni1-N1，Ni1-O3 的 鍵 長 均 不 等 ， 在0.204 9（4）～0.206 2（4）nm 范圍內(nèi)。配位鍵角 O1-Ni1-O1i，O1-Ni1-O3，O3-Ni1-O3i，O3-Ni1-O1i在 87.2（2）°～92.56（16）°范圍內(nèi)，接近 90°，即 O1，O1i，O3，O3i基本處于同一平面。 配位鍵角 N1-Ni1-N1i為 166.1（3）°。因此，中心鎳ギ離子形成以 O1，O1i，O3，O3i作為赤道平面，N1，N1i占據(jù)軸向位置的扭曲八面體幾何構(gòu)型。

頭孢氨芐在配位過程中發(fā)生了較大的變化。由于反應(yīng)體系為弱酸條件，使得側(cè)鏈的氨基N原子質(zhì)子化，且因?yàn)榻饘匐x子的存在促進(jìn)了頭孢氨芐的水解，β-內(nèi)酰胺環(huán)上的C-N鍵斷裂，形成一個新的羧基[17-18]，從而得到了相應(yīng)的頭孢菌素中間體cephalosporoate （cepha）[19]。配體 cepha 上的 O 原子和雙氫噻嗪環(huán)上的N原子與金屬離子配位形成穩(wěn)定的六元環(huán)。鄰位的羧基去質(zhì)子化，其上的O原子與金屬離子配位形成一個穩(wěn)定的五元環(huán)。雙氫噻嗪環(huán)上的N1-C2 和 C2-C3 鍵長分別為 0.127 8（5）和 0.151 1（8）nm，但在頭孢氨芐晶體結(jié)構(gòu)中相應(yīng)的鍵長分別為0.141 5（1）和 0.133 3（2）nm[20]，對應(yīng)于 C-N 單鍵和 C=C雙鍵，說明頭孢氨芐的雙鍵位置從3位-4位移動到4位-5位，形成C-C單鍵和C=N雙鍵，這與頭孢氨芐水解的結(jié)果一致[21-22]。

圖 1 配合物 1 （a）和 2 （b）的 ORTEP 圖Fig.1 ORTEPview of complexes 1 （a）and 2 （b）

表2 配合物1和2的部分鍵長(nm）和鍵角(°）Table 2 Selected bond lengths(nm）and angles(°）for complexes 1 and 2

表3 配合物1和2的氫鍵參數(shù)Table 3 Structural parameters of hydrogen bonds for complexes 1 and 2

續(xù)表3

圖2 配合物1的晶胞堆積圖Fig.2 Crystal packing diagram of complex 1 from b axis

配合物1的堆積圖如圖2所示，配合物分子中的配體分子上未配位的羧基O原子，側(cè)鏈氨基N原子，側(cè)鏈酰胺羰基O原子以及晶格水分子的存在，使配合物形成大量N-H…O和O-H…O形式的氫鍵，并依靠這些分子間氫鍵作用將單核配合物分子組裝形成三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。

配合物2與配合物1結(jié)構(gòu)相同。

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)配合物的純度，我們對配合物1和2進(jìn)行了X射線粉末衍射分析，如圖3所示。通過對比可以發(fā)現(xiàn)配合物1和2的特征峰位置與單晶結(jié)構(gòu)模擬的X射線粉末衍射圖譜一致，表明配合物為高純度單晶。

圖3 配合物1和2的X射線粉末衍射圖Fig.3 PXRD patterns for complexes 1 and 2

2.2 配合物的紅外光譜

頭孢氨芐及配合物1和2的紅外光譜如圖4所示。可以看到配合物1和2的紅外譜圖與頭孢氨芐的紅外譜圖存在明顯的差異。頭孢氨芐在1 758 cm-1處出現(xiàn)了 β-內(nèi)酰胺環(huán)的 ν（C=O）特征吸收峰，但配合物譜圖中該特征吸收峰消失了，表明頭孢氨芐的β-內(nèi)酰胺環(huán)參與配位或者發(fā)生水解[23]。頭孢氨芐的另一個特征吸收峰出現(xiàn)在1 690 cm-1，對應(yīng)于側(cè)鏈酰胺的ν（C=O）吸收峰。而配合物的紅外光譜中相應(yīng)吸收峰沒有發(fā)生較大的位移，表明側(cè)鏈酰胺沒有直接參與配位。同時，配合物在1 600和1 380 cm-1附近出現(xiàn)新的吸收峰，分別對應(yīng)于羧酸鹽的不對稱伸縮振動 νas（COO-）和對稱伸 縮 振 動 νs（COO-）。 這是羧基參與配位的依據(jù)，且1和2的分離值 （Δν=νas（COO-）-νs（COO-）分別為 207 和 218 cm-1，表明羧基以單配位模式與金屬配位[24]，這與單晶結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。頭孢氨芐中的β-內(nèi)酰胺和雙氫噻唑環(huán)共有的ν（C-N）在1 354 cm-1出現(xiàn)特征吸收峰，但配合物中該特征峰消失了，表明β-內(nèi)酰胺和雙氫噻唑環(huán)上的N原子參與配位[2,25]。此外，與配體相比配合物的紅外光譜在600～400 cm-1處發(fā)生了很大的變化，在這一區(qū)域出現(xiàn)了金屬與氧原子成鍵的特征吸收峰 ν（Ni-O）=504 cm-1和 ν（Zn-O）=507 cm-1以及金屬和氮原子成鍵的特征吸收峰ν（Ni-N）=483 cm-1和ν（Zn-N）=480 cm-1。頭孢氨芐的紅外光譜還在 3 000～3 200 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了一組吸收峰，為氨基的ν（N-H），但配合物中的該譜帶保持不變，且在2 600 cm-1處的寬峰可歸因于 R-NH3+的 ν（N-H），顯示側(cè)鏈氨基單質(zhì)子化而沒有參與配位。

圖4 頭孢氨芐、配合物1和2的紅外光譜Fig.4 IR spectra of cephalexin,complexes 1 and 2

配合物在3 490 cm-1有一組可歸屬于水分子ν（O-H）的強(qiáng)而寬吸收峰，說明配合物中可能含有配位水或結(jié)晶水，但在 550 cm-1沒有出現(xiàn) ρw（H2O）的特征吸收峰表示水分子并沒有參與配位。因此，配合物中的水分子都是結(jié)晶水。

2.3 配合物的熱重分析

為了研究配合物的穩(wěn)定性，我們對其進(jìn)行了熱重分析，圖5為配合物1和2從室溫到800℃的TG曲線。從配合物1的TG曲線可以看出，其分解過程主要分為3個步驟：首先從室溫到160℃范圍內(nèi)，出現(xiàn)明顯的失重現(xiàn)象，質(zhì)量損失為12.3%（計(jì)算值12.1%），對應(yīng)于配合物1失去全部6個水分子。隨著溫度升高，配合物1在一段時間內(nèi)較為穩(wěn)定。當(dāng)溫度升至200℃時左右時再次出現(xiàn)失重現(xiàn)象，這主要是無水配合物的進(jìn)一步分解。該過程較為復(fù)雜，可解釋為配合物的雙氫噻嗪環(huán)的一側(cè)發(fā)生熱分解，質(zhì)量損失為 47.2%（計(jì)算值 47.4%）[26-27]。 最后，在500～800℃范圍內(nèi)，剩下的苯環(huán)部分進(jìn)一步分解，質(zhì)量損失為30.1%（計(jì)算值30.2%）[28]。配合物2的熱分解過程與配合物1相似，先失去6個水分子，并且在200℃左右無水配合物進(jìn)一步分解。配合物1和2熱分解最后剩余的固體殘?jiān)鼮橄鄳?yīng)的金屬氧化物[29]，對應(yīng)質(zhì)量分別為 9.4%（計(jì)算值 8.4%）和 9.5%（計(jì)算值 9.2%）。

圖5 配合物1和2的TG曲線Fig.5 TGcurves of complexes 1 and 2

2.4 配合物的體外抗腫瘤活性

為研究配合物的體外抗腫瘤活性，采用MTT比色法測定了金屬醋酸鹽、頭孢氨芐、配合物1和2對腫瘤細(xì)胞抑制增殖活性，結(jié)果如圖6所示。頭孢氨芐單配體隨著濃度的增加，對乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和人肝癌細(xì)胞（HepG-2）的抑制效果均不明顯。但是配合物對MCF-7細(xì)胞有一定的抑制活性，且隨濃度增大而逐漸增強(qiáng)，表明其對腫瘤細(xì)胞的抑制活性存在劑量依賴性。而配合物對HepG-2細(xì)胞的抑制增殖作用在低濃度時并不明顯，當(dāng)濃度高于100 μmol·L-1時，細(xì)胞存活率明顯下降。在相同濃度下，配合物2對MCF-7細(xì)胞的活性強(qiáng)于配合物1。此外，相應(yīng)的金屬醋酸鹽對MCF-7和HepG-2也有一定抑制活性。這說明金屬元素的參與，增強(qiáng)了配合物的抗腫瘤活性，且金屬元素的種類對配合物的抗腫瘤活性存在影響。

圖6 金屬醋酸鹽、頭孢氨芐、配合物1和2在不同濃度下對MCF-7（a）和HepG-2（b）細(xì)胞活力影響曲線Fig.6 Cell viability curves of MCF-7 （a）and HepG-2 （b）at different concentration of metal acetates,cephalexin,complexes 1 and 2

3 結(jié) 論

以頭孢氨芐為原料合成鋅和鎳的配合物時，頭孢氨芐在配位過程中發(fā)生水解，產(chǎn)生相應(yīng)的頭孢菌素中間體cepha。配體cepha的氧原子和雙氫噻嗪環(huán)上的氮原子以及側(cè)鏈羧基氧原子一起與金屬離子配位，得到2個結(jié)構(gòu)類似的單核配合物[Ni（cepha）2]·6H2O （1）和[Zn（cepha）2]·6H2O （2）。1 和 2 均通過分子間氫鍵將配合物組裝成穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。2種配合物在200℃時仍有較好的熱穩(wěn)定性。通過MTT法研究配體、醋酸鹽和配合物的體外抗腫瘤活性，結(jié)果表明頭孢氨芐對乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和人肝癌細(xì)胞（HepG-2）沒有抑制增殖作用，但2個配合物對2種癌細(xì)胞則表現(xiàn)出一定的體外抗腫瘤活性，且配合物2對MCF-7細(xì)胞的抑制活性強(qiáng)于配合物1。