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(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系,廣東廣州510632; 2.廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,廣西崇左532415)

澳洲堅(jiān)果(MacadamiaternifoliaF. Muell.)是山龍眼科、澳洲堅(jiān)果屬植物,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值高,原產(chǎn)于澳大利亞[1],世界熱帶地區(qū)均已有栽培,我國(guó)云南、廣東、廣西等省已大量栽培。澳洲堅(jiān)果果實(shí)由外殼(青皮)、殼(木質(zhì)硬殼)和果仁組成[2]。其中,圓形、奶香味的果仁是其唯一的可食用部分,營(yíng)養(yǎng)豐富,除高含量的脂質(zhì)(60%以上)外,還含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、多種重要微量元素和其他生物活性物質(zhì),屬高檔干果,有“干果之王”之稱。

澳洲堅(jiān)果品種甚多,但僅光殼型澳洲堅(jiān)果(M.Integrifolia)和粗殼澳洲堅(jiān)果(M.Tetraphylla)及其雜交種有商業(yè)價(jià)值,其他品種均因其果仁中的蜀黍苷(圖1,I,一種生氰糖苷)含量較高而不宜食用，或脫氰后才可以食用[3]。Miller等[4]對(duì)澳洲堅(jiān)果幼苗中的生氰糖苷進(jìn)行測(cè)定,稱多數(shù)澳洲堅(jiān)果品種含有蜀黍苷與proteacin兩種生氰糖苷,但成熟澳洲堅(jiān)果各部位蜀黍苷的含量目前仍未見(jiàn)有報(bào)道。而我國(guó)廣西、云南等地現(xiàn)有用澳洲堅(jiān)果花、葉泡茶[5],其青皮用作飼料或生產(chǎn)抗氧化劑[6]和化妝水[7],其殼用于生產(chǎn)吸附劑[8]等方面的報(bào)道,故有必要對(duì)澳洲堅(jiān)果各部位的糖苷毒性進(jìn)行評(píng)估,以保證其用于食品、化妝品和其他領(lǐng)域產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用的安全性。

圖1 蜀黍苷酶解途徑和苦杏仁苷分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Enzymatic hydrolysis pathway of dhurrin and the molecular structure of amygdalin

由蜀黍苷生成氫氰酸(HCN)分為兩步。其先被內(nèi)源性蜀黍苷酶(dhurrinase,EC 3.2.1.21,屬于β-D-葡萄糖苷酶)水解,生成葡萄糖和不穩(wěn)定的對(duì)羥基-(S)-扁桃腈(圖1,II);此中間產(chǎn)物再在內(nèi)源性R-羥基腈裂解酶的作用下或堿性條件下,快速轉(zhuǎn)化為游離HCN和對(duì)羥基苯甲醛(見(jiàn)圖1)。

生氰糖苷含量的測(cè)定方法包括間接法和直接法。間接法主要通過(guò)檢測(cè)糖苷水解所釋放的HCN以定量生氰糖苷,常用的有巴比妥酸法[9]、堿性苦味酸鹽法[10]、硝酸銀滴定法、分光光度法[11]、氰化物電極測(cè)定法[12]等。這些方法所用儀器簡(jiǎn)單,但精密度、準(zhǔn)確度均較低。為準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)澳洲堅(jiān)果中的生氰糖苷,本實(shí)驗(yàn)擬選用價(jià)廉易得的苦杏仁苷(圖1,IV)作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì),用高壓液相色譜法(HPLC)直接定量樣品中的蜀黍苷,為成熟澳洲堅(jiān)果各部位的毒性評(píng)估和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

澳洲堅(jiān)果仁及其油粕、花、葉、青皮、殼 均由廣西省壽香鄉(xiāng)有機(jī)農(nóng)業(yè)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)有限公司惠贈(zèng)(品種包括HAES900、桂熱、Own Choice、A16、Pahala、Beaumont,其中所用果仁、青皮和殼取自成熟果實(shí),葉子為幼葉);水：怡寶純凈水 華潤(rùn)怡寶食品飲料(深圳)有限公司;0.45 μm微孔濾膜 天津津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司;蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥90%,經(jīng)歸一化法測(cè)定后,按90%計(jì)算 法國(guó)Extrasynthése公司;苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥98%，成都德斯特生物技術(shù)有限公司;乙腈 HPLC級(jí)，歐普森試劑有限公司;無(wú)水乙醇 HPLC級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲酸 分析純，天津化學(xué)試劑一廠。

Shimadzu LC-20AT 高效液相色譜儀 日本島津公司;Alltech ELSD 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 美國(guó)Alltech公司;FA1104N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SB-5200DTS超聲波清洗機(jī) 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司;KDC-1044離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;111型高速中藥粉碎機(jī) 瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取與制備

1.2.1.1 澳洲堅(jiān)果花與葉待測(cè)樣品的制備 參考Kobaisy等[13]所述方法進(jìn)行澳洲堅(jiān)果中蜀黍苷的提取,將澳洲堅(jiān)果花、葉凍干粉碎后,精密稱取0.33 g于50 mL容量瓶中,70%乙醇定容后室溫下超聲30 min。取出,放置過(guò)夜。第二天定容后取適量提取液3500 r/min離心30 min。取一定量該上清液,加入已知濃度的苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后置于1.5 mL自動(dòng)進(jìn)樣瓶,HPLC檢測(cè)。

1.2.1.2 澳洲堅(jiān)果仁和青皮、果殼樣品的制備 澳洲堅(jiān)果仁稱重,粉碎后用正己烷脫脂,干燥至恒重,記錄重量。澳洲堅(jiān)果冷榨油粕亦用正己烷脫脂后干燥至恒重。稱取1.36 g脫脂油粕粉置于50 mL 容量瓶中;將澳洲堅(jiān)果青皮、殼樣品進(jìn)行干燥,粉碎,精密稱取2 g于100 mL容量瓶中,70%乙醇定容,其余步驟同澳洲堅(jiān)果花和葉的處理過(guò)程。

1.2.2 HPLC和HPLC-MS分析條件 使用Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)柱溫35 ℃;流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%甲酸溶液(B)進(jìn)行梯度洗脫[14],優(yōu)化洗脫梯度如表1所示,進(jìn)樣量5 μL,流速:1.0 mL/min;ELSD以干燥潔凈的壓縮空氣為霧化氣體,壓力0.5 MPa,氣體流速3.0 L/min,漂移管溫度100 ℃,增益值1。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí),該條件下,方法噪音信號(hào)較小,基線平穩(wěn)。通過(guò)比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積可對(duì)樣品中的蜀黍苷進(jìn)行定性定量分析。

表1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution of HPLC analysis

質(zhì)譜條件為:ESI為離子源,同時(shí)進(jìn)行正、負(fù)離子模式掃描,離子源溫度350 ℃,霧化壓力25 psi,干燥氣體為N2，流速10 L/min,CID氣流230 kPa,DL溫度250 ℃,加熱塊溫度400 ℃,接口溫度300 ℃,質(zhì)量掃描范圍m/z為300～550。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 精密稱取5.2 mg蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品,甲醇溶解定容并進(jìn)行稀釋,得濃度分別為0.52、0.38、0.26、0.13、0.065、0.0325 mg/mL的系列蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液(-20 ℃保存,1個(gè)月內(nèi)用完[15])。另精密稱取8.3 mg內(nèi)標(biāo)物苦杏仁苷,用甲醇溶解并定容至25 mL,得濃度0.332 mg/mL的苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述不同梯度蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 mL于5 mL容量瓶中,各加2 mL苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,甲醇定容至刻度,搖勻,即得含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的系列梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后置于1.5 mL進(jìn)樣瓶中,HPLC分析,分別記錄蜀黍苷與苦杏仁苷的峰面積。

式(1)

式中,ωD為樣品中蜀黍苷的含量(mg/g),ci(mg/mL)為使用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線所得樣品提取液中蜀黍苷的濃度(mg/mL),Vextr為提取液總體積(mL),m為樣品重量(g)。

1.2.5 方法學(xué)試驗(yàn)

1.2.5.1 精密度試驗(yàn) 按照1.2.3中的方法精確配制濃度分別為0.21、0.27 mg/mL的蜀黍苷-苦杏仁苷甲醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,進(jìn)樣體積為5 μL,對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的精密度進(jìn)行分析。

1.2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 平行提取澳洲堅(jiān)果花樣品5份,每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣5次以考察HPLC分析的重復(fù)性。

1.2.5.3 回收率試驗(yàn) 以澳洲堅(jiān)果花為分析對(duì)象,5個(gè)平行樣品分別加入一定量不同濃度的蜀黍苷-苦杏仁苷混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(其中蜀黍苷濃度分別為0.013、0.0104、0.0078、0.0052和0.0026 mg/mL,苦杏仁苷濃度分別為0.107、0.0785、0.0615、0.0415、0.027 mg/mL)進(jìn)行提取。每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣兩次,取其平均值后,按照1.2.2所述標(biāo)準(zhǔn)曲線定量提取液中的蜀黍苷,并與添加量進(jìn)行比較以計(jì)算回收率。

1.2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備澳洲堅(jiān)果花提取液,分別于0、2、4、8、24 h測(cè)定蜀黍苷含量,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用Microsoft Excel和SPSS進(jìn)行分析,取3次或5次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,并對(duì)幾次平行結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦杏仁苷符合測(cè)定蜀黍苷內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)比蜀黍苷(圖1,I)與苦杏仁苷(圖1,IV)的分子式可以看出:兩者結(jié)構(gòu)相近,應(yīng)當(dāng)具有類似的色譜行為。由圖2可以看出:蜀黍苷(圖2A峰)保留時(shí)間6.960 min,峰型對(duì)稱,分離效果良好;苦杏仁苷(圖2B峰)保留時(shí)間為7.351 min,與蜀黍苷峰相近且完全分離,無(wú)干擾,即苦杏仁苷與蜀黍苷保留時(shí)間較為接近,可以作為澳洲堅(jiān)果中蜀黍苷測(cè)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。此外,在相同實(shí)驗(yàn)條件下,蜀黍苷與苦杏仁苷的相對(duì)保留時(shí)間(蜀黍苷保留時(shí)間/苦杏仁苷保留時(shí)間)約為0.95∶1,可在本洗脫、測(cè)定條件下,作為蜀黍苷的定性分析作參考指標(biāo)。

圖2 澳洲堅(jiān)果花提取樣品的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of macadamia flower extraction注:3為蜀黍苷與苦杏仁苷混合標(biāo)準(zhǔn)品,2為加入苦杏仁苷的澳洲堅(jiān)果花提取液,1為未加苦杏仁苷的澳洲堅(jiān)果花提取液。

采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)圖2A峰進(jìn)行測(cè)定,在ESI正離子模式下,該峰的一級(jí)質(zhì)譜離子峰為:[M+NH4]+329,[M+Na]+334,[M+K]+350;負(fù)離子模式下,離子峰為:[M-H]-310,[M+Cl]-346,[M+HCOO]-356。據(jù)這些相關(guān)峰,可以計(jì)算出準(zhǔn)分子離子峰的分子量M為311,而蜀黍苷分子式C14H17NO7,其分子量也是311。從上述HPLC保留時(shí)間與HPLC/MS兩方面的證據(jù),均證實(shí)圖2A峰為蜀黍苷。由此可見(jiàn),澳洲堅(jiān)果樣品中不含苦杏仁苷(圖2B)、而兩種生氰糖苷色譜行為相同,即杏仁苷可以作為內(nèi)標(biāo)測(cè)定澳洲堅(jiān)果中的蜀黍苷。

2.2 蜀黍苷的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

將一定濃度的蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋,并用HPLC定量檢測(cè),信噪比為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的蜀黍苷溶液濃度即為本方法的檢出限。結(jié)果顯示,檢出限為3.0×10-3mg/mL,檢測(cè)范圍為0.0330～0.4554 mg/mL。

2.3 方法學(xué)試驗(yàn)

按1.2.5所述進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn),所獲結(jié)果見(jiàn)表2。精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD為2.60%,儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的RSD為1.50%,表明方法重復(fù)性良好。24 h內(nèi),樣品中蜀黍苷定量結(jié)果的RSD為0.82%,平均回收率為97.93%±2.35%,RSD為2.39%,檢測(cè)結(jié)果可靠。因此,從穩(wěn)定性、回收率、準(zhǔn)確度等方面考慮,該法是測(cè)定澳洲堅(jiān)果中的蜀黍苷含量的適宜方法。

表2 方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of methodology test

2.4 澳洲堅(jiān)果各部位蜀黍苷的含量和毒性評(píng)估

2.4.1 澳洲堅(jiān)果各部位蜀黍苷的含量 HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法測(cè)定澳洲堅(jiān)果各部位蜀黍苷含量的結(jié)果見(jiàn)表3,其中澳洲堅(jiān)果花中蜀黍苷的含量最高(49.92±0.96) mg/g,其后依次為葉>青皮>殼>油粕>果仁,這與Dahler等[17]所述生氰糖苷主要存在于生長(zhǎng)代謝旺盛組織的報(bào)道一致。由表4可知,不同品種澳洲堅(jiān)果青皮中蜀黍苷含量存在較大差異,其中含量最少的為Pahala,測(cè)定結(jié)果為(0.51±0.03) mg/g;含量最高的為Beaumont,測(cè)定結(jié)果為(5.74±0.08) mg/g,相差2～15倍。因此,在選育澳洲堅(jiān)果品種、考慮利用澳洲堅(jiān)果青皮資源時(shí),應(yīng)當(dāng)以蜀黍苷含量作為重要品質(zhì)指標(biāo)之一。

表3 澳洲堅(jiān)果不同部位蜀黍苷的含量(不同品種的平均值)Table 3 Dhurrin content in different part of macadamia(Average value of different cultivars)

表4 不同品種澳洲堅(jiān)果青皮中蜀黍苷的含量Table 4 Dhurrin content in different macadamia husks

2.4.2 澳洲堅(jiān)果各部位用作食品原料的安全性分析 生氰糖苷的毒性是由其水解所得氰氫酸和醛類化合物產(chǎn)生的,氰氫酸最小致死口服劑量為0.5～3.5 mg/kg體重[18]。而對(duì)于人體,若體重按50 kg算,口服約25 mg HCN致死;換算成對(duì)應(yīng)蜀黍苷含量(假設(shè)完全水解成產(chǎn)物),該劑量相當(dāng)于澳洲堅(jiān)果花、葉、果仁、油粕、殼、青皮(干重計(jì))分別為19.58、36.04、1078、308.27、709.38、269.56 g?？梢钥闯?澳洲堅(jiān)果仁蜀黍苷含量最低,而且每日攝入量一般小于100 g,因此,食用澳洲堅(jiān)果仁不會(huì)導(dǎo)致氫氰酸中毒,即食用澳洲堅(jiān)果仁是安全的。但澳洲堅(jiān)果花、葉、油粕、殼、青皮中蜀黍苷含量則相對(duì)較高,尤其是花的含量最高;若將花、葉等部位用于生產(chǎn)茶類(每天攝入量小于2～4 g)時(shí),亦應(yīng)當(dāng)是安全的;但若將其用作飼料,由于牲畜日攝入量比較大,則應(yīng)考慮脫除蜀黍苷以保證牲畜安全。實(shí)際上,蜀黍苷酶解不可能完全產(chǎn)生游離HCN,其具體的轉(zhuǎn)化率則視植物組織受損情況、環(huán)境溫度、pH等諸多因素影響,故具體的轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)還有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。因此,如果擬利用澳洲堅(jiān)果花、幼葉加工花茶、浸泡酒等食品時(shí),應(yīng)當(dāng)考慮脫除其所含的蜀黍苷;而澳洲堅(jiān)果的青皮、殼、油粕、果仁中蜀黍苷含量一般低于5 mg/g,可以不采用脫除蜀黍苷的工藝處理措施。

3 結(jié)論

選用苦杏仁苷作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì),使用HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法對(duì)澳洲堅(jiān)果花、葉、果仁、青皮和殼中的蜀黍苷進(jìn)行定量檢測(cè),試驗(yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好,可作為澳洲堅(jiān)果中蜀黍苷的一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)澳洲堅(jiān)果不同部位蜀黍苷含量進(jìn)行定量分析,其中花中蜀黍苷含量最高,葉次之,而果仁中僅含微量的蜀黍苷,在安全食用范圍之內(nèi)?？嘈尤省y杏等中草藥中所含的生氰糖苷,常常是其重要的活性成分;而對(duì)于單蜀黍苷的生物活性則有待進(jìn)一步研究。