肉制品鑒別的分子生物學(xué)方法研究進(jìn)展

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(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006; 2.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510623)

古書《五燈會(huì)元》中有“懸羊頭,賣狗肉”一說,原以此借喻表里不一,但在食品安全中,卻屢屢出現(xiàn)真實(shí)的掛羊頭賣狗肉事件,現(xiàn)今世界各國(guó)每年都會(huì)有許多肉類摻假事件被曝光:2013年初的歐洲馬肉風(fēng)波;2013年末的沃爾瑪超市狐貍?cè)鈸郊偈录?2015年初“憶思”牌牛肉干事件等等。這些食品摻假事件被統(tǒng)稱為“經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)的摻假”(Economically Motivated Adulteration,EMA)。

從2013年開始,我國(guó)就穩(wěn)居世界第一大肉類生產(chǎn)國(guó),年產(chǎn)量逐年上漲,國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示2017年豬牛羊禽肉產(chǎn)量8431萬噸。我國(guó)肉類生產(chǎn)成本高導(dǎo)致各種肉類的價(jià)格高、差異大,市場(chǎng)中存在大量低價(jià)肉冒充高價(jià)肉,非食用肉冒充食用肉的現(xiàn)象。據(jù)新發(fā)地批發(fā)市場(chǎng)報(bào)價(jià),禽類與豬肉,豬肉與牛、羊肉有幾倍的差價(jià),這種高額的利潤(rùn)使得不法分子鋌而走險(xiǎn),食品摻假屢禁不止。2013年,我國(guó)部分地區(qū)開展了肉及其制品的摻假情況調(diào)查,結(jié)果顯示有25.6%的樣品與標(biāo)識(shí)不符。這些違法行為不僅侵害了人民的合法權(quán)益、損害了人民的身體健康,而且當(dāng)豬肉制品摻入到清真食品中造成的惡劣影響會(huì)引發(fā)宗教事件,不利于社會(huì)的和諧穩(wěn)定。

由于監(jiān)管需求,各種動(dòng)物物種檢測(cè)技術(shù)相繼被開發(fā)出來。最初檢驗(yàn)人員使用顯微鏡識(shí)別區(qū)分不同物種,以發(fā)現(xiàn)造假行為,后來科學(xué)家又開發(fā)出基于蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的檢測(cè)方法,主要包括光譜學(xué)方法、免疫學(xué)方法、色譜和質(zhì)譜技術(shù),然而這些方法技術(shù)都存在著各種弊端,光譜學(xué)方法需要建立復(fù)雜的模型,但模型不具有通用性;免疫學(xué)方法的靈敏度偏低,存在較多的假陽性結(jié)果;色譜和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備的要求比較高,并且容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果,因此這些方法不能很好的滿足監(jiān)管的需求。在過去二十年里,基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅猛,因?yàn)楹怂岽嬖谟诖蠖鄶?shù)細(xì)胞中,其結(jié)構(gòu)保守,高溫下具有更好的穩(wěn)定性。所以隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的蓬勃發(fā)展,使得肉類物種鑒別有了真正可靠的方法技術(shù)。

本文主要對(duì)禽畜魚的原料肉及加工肉制品的七種分子生物學(xué)摻假鑒別方法的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹和分析,并對(duì)未來的研究方向進(jìn)行了探討和展望。

1 常規(guī)PCR方法

PCR是一種生物體外的聚合鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng),可以在幾小時(shí)內(nèi)通過引物和酶對(duì)特定的核酸序列進(jìn)行數(shù)百萬次擴(kuò)增。這種技術(shù)由Mullis等[1]發(fā)明。常規(guī)PCR方法的原理是經(jīng)PCR擴(kuò)增特異性片段后,利用瓊脂糖凝膠電泳,觀察電泳后的結(jié)果,根據(jù)陰陽性或片段大小以鑒定區(qū)分不同物種。已經(jīng)成為肉類摻假檢驗(yàn)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)方法,得到了廣泛的應(yīng)用。

Cunningham等[2]證明PCR方法在活體動(dòng)物和動(dòng)物制品的檢測(cè)上很有幫助。Herman等[3]采用細(xì)胞色素b序列設(shè)計(jì)引物,成功的檢測(cè)出食品中的雞、火雞、豬、牛、綿羊成分。Piknova等[4]也利用細(xì)胞色素b序列檢測(cè)出食品中的牛成分。Montiel等[5]設(shè)計(jì)了基于D環(huán)區(qū)的引物,可以在腌制或熱加工食品中擴(kuò)增出531 bp的DNA序列,以此來鑒別豬肉。他們還通過簡(jiǎn)單的AvaII分析來分辨野豬和家豬。Calvo等[6]設(shè)計(jì)了豬的特異性引物,在豬的生熟肉、香腸、煙熏肉、餡餅等各種加工品中成功的檢測(cè)出了豬肉。這個(gè)方法也用在了生熟牛肉和鴨肉中豬肉的檢測(cè)。Arslan等[7]設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同加工方法對(duì)于線粒體DNA的PCR擴(kuò)增的效果的影響,在煮、烤、高壓和煎等烹飪方法中,除煎制80 min后的樣品,其余加工后樣品均檢測(cè)出牛源性成分。這些科學(xué)家的實(shí)驗(yàn)結(jié)論說明了DNA在高溫高壓加工處理后仍具備PCR擴(kuò)增的能力,也證明了PCR方法可以應(yīng)用于加工肉制品的檢測(cè)中。Ilhak等[8]采用一種鑒別的新思路,通過PCR擴(kuò)增馬、狗、貓、牛、綿羊、豬和山羊,最終產(chǎn)物分別為439、322、274、271、225、212、157 bp,觀察瓊脂糖凝膠電泳中片段的大小,最低可以鑒定出混合肉中0.1%含量的摻假成分。Kesmen等[9]開發(fā)了一種高效的特異性PCR方法,利用線粒體DNA設(shè)計(jì)引物,可以檢測(cè)出香腸中低含量的豬肉、馬肉和驢肉,最低可檢測(cè)0.01 ng的目標(biāo)DNA。當(dāng)使用混合肉樣進(jìn)行檢測(cè)時(shí),可以檢測(cè)出低至0.1%含量的物種源性成分。常規(guī)的PCR方法的應(yīng)用開創(chuàng)了物種鑒別的PCR時(shí)代,由于常規(guī)PCR方法一次只能檢測(cè)一種物種,局限性大,科學(xué)家又在此基礎(chǔ)上開發(fā)了其他新型PCR方法。

2 多重PCR方法

多重PCR方法是將多個(gè)引物對(duì)用在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中,利用一個(gè)模板反應(yīng)可以得到多個(gè)擴(kuò)增片段。利用此方法,在一次PCR反應(yīng)中使用基于細(xì)胞核DNA和線粒體DNA的多個(gè)引物對(duì),可以精確檢測(cè)多種物種成分。

Fei等[10]利用D環(huán)區(qū)設(shè)計(jì)引物,通過多重PCR反應(yīng)可以一次性鑒定牛肉、豬肉和雞肉。Behrens等[11]利用多重PCR對(duì)復(fù)雜樣品中的雞肉、火雞肉、牛肉、豬肉、山羊肉、驢肉和馬肉進(jìn)行區(qū)分鑒定,其中加工后樣品的最低檢測(cè)限為1%。Yin等[12]使用12S rRNA基因序列,設(shè)計(jì)了三對(duì)引物,利用多重PCR方法,對(duì)牦牛肉和牛肉進(jìn)行鑒別,牛肉的PCR反應(yīng)產(chǎn)物有兩種片段,大小分別為290、159 bp,而牦牛肉的PCR反應(yīng)產(chǎn)物只有一種片段,大小為290 bp。利用這種方法,可以對(duì)牦牛和牛的混合生肉和混合熟肉進(jìn)行區(qū)分鑒定,得到了很好的效果,其中牛肉的檢測(cè)低限在0.1%。張全芳等[13]利用16S rRNA序列的差異,設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行多重PCR可以成功區(qū)分綿羊、山羊和狐貍。多重PCR依據(jù)不同的需要從最初的雙重PCR發(fā)展為四重PCR[14]、五重PCR[15-16]和六重PCR[17-18]甚至七重PCR[19-20],同時(shí)檢測(cè)的物種數(shù)量逐步增多。多重PCR技術(shù)完美繼承了常規(guī)PCR的優(yōu)點(diǎn),又可以在同一次反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)物種,大大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。

3 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR方法

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR方法是利用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增出目標(biāo)片段,然后將產(chǎn)物用特異性內(nèi)切酶消化切割為不同長(zhǎng)度的片段,最后通過瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳等方法,觀察分析電泳結(jié)果得出結(jié)論。

Ali等[21]利用豬的細(xì)胞色素B基因設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析,能夠成功的檢測(cè)到0.0001 ng的純豬肉,并且可以在豬肉、牛肉和小麥的混合物中檢測(cè)出豬源性成分,最低檢測(cè)限可達(dá)0.01%。Ong等[22]利用細(xì)胞色素B基因,經(jīng)過一輪PCR反應(yīng)后,分別使用不同的內(nèi)切酶處理PCR產(chǎn)物,豬肉產(chǎn)物可以分別被AluI和BsaI切割成兩個(gè)片段,雞肉產(chǎn)物可以被RsaI切割成兩個(gè)片段,牛肉產(chǎn)物可以被AluI切割為三個(gè)片段,被BsaI切割成兩個(gè)片段,這些片段的大小均不相同,利用瓊脂糖凝膠電泳可以清晰觀察并得出模板的動(dòng)物種類,一輪PCR反應(yīng)可以分辨多種物種,節(jié)約了成本。Sun等[23]在PCR反應(yīng)中加入R6G dCTP,生成帶有熒光信號(hào)的產(chǎn)物,酶切后利用毛細(xì)管電泳分析,可以在肉類混合物中分別檢測(cè)出低于1%含量的豬、羊和牛源性成分,并且烹飪和高壓處理不會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。Yuny等[24]利用RFLP方法對(duì)印尼地區(qū)的部分牛肉丸進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了一些牛肉丸中有豬肉的陽性信號(hào),證明了RFLP方法在實(shí)際監(jiān)管過程中能夠起到檢測(cè)的作用。RFLP方法雖然有著很好的檢測(cè)效果,但是其可重復(fù)性偏低,易受到內(nèi)切酶的影響,并且比常規(guī)PCR方法復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)成本高,因此在實(shí)際監(jiān)管中應(yīng)用較少。

4 DNA分子雜交方法與基因芯片技術(shù)

DNA分子雜交檢測(cè)技術(shù)是將生物體內(nèi)的DNA雙鏈變性為DNA單鏈,人為添加帶有熒光或同位素的互補(bǔ)鏈,如果兩者之間形成堿基互補(bǔ),那么會(huì)檢測(cè)到陽性信號(hào)。

這種技術(shù)在1987年第一次應(yīng)用于肉類檢測(cè)中[25],Buntjer等[26]建立了牛、羊、馬、雞、豬等多種物種的分子雜交檢驗(yàn)方法,在混合肉中可以檢測(cè)到最低1%的動(dòng)物源性成分,在4 h內(nèi)可以檢測(cè)50種樣品,并且對(duì)于熱加工的樣品依然具有很好的檢測(cè)效果。Buntjer等[27]對(duì)加工肉制品作為樣品的DNA雜交進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)肉的冷凍與解凍過程不會(huì)影響DNA雜交的效果,而100、120 ℃的高溫處理可能會(huì)導(dǎo)致DNA的降解,但是不會(huì)影響最終的物種鑒別。DNA雜交技術(shù)作為一種基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù),存在有耗時(shí)長(zhǎng),靈敏度低等許多缺陷,所以科學(xué)家發(fā)明了一些基于DNA雜交原理的改進(jìn)版新型檢測(cè)技術(shù)[28]。

基因芯片技術(shù)是基于DNA分子雜交原理的新型檢測(cè)技術(shù),其將大量的探針序列固定在支持物上面,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品快速方便的檢測(cè)。朱業(yè)培等[29]建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)牛、羊、豬、馬、鹿和兔6種物種源性的基因芯片,牛源性成分和馬源性成分的相對(duì)檢測(cè)低限達(dá)到了0.001%。Kochzius等[30]開發(fā)了一種含有64個(gè)探針的基因芯片,利用一張芯片可以同時(shí)檢測(cè)30種不同的魚類。DNA芯片技術(shù)結(jié)合了PCR和DNA雜交的優(yōu)點(diǎn),逐漸得到監(jiān)管部門和食品行業(yè)的重視。目前采用DNA芯片技術(shù)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法《常見動(dòng)物源性成分快速測(cè)定 膜芯片法 GB/T 35917-2018》已經(jīng)起草即將于2018年9月1日實(shí)施。隨著國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的即將實(shí)施,此方法將越來越多的應(yīng)用于實(shí)際檢驗(yàn)中。

5 實(shí)時(shí)熒光PCR方法

實(shí)時(shí)熒光PCR方法是在常規(guī)的PCR體系中添加熒光基團(tuán),利用機(jī)器監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化,可以實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)過程,以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定性和相對(duì)定量。在物種鑒別中,熒光PCR方法是比較先進(jìn)的技術(shù),結(jié)果直觀易觀察,避免了瓊脂糖凝膠電泳中的污染問題。

Wolf和Jurg[31]使用基于生長(zhǎng)激素基因設(shè)計(jì)的引物,對(duì)豬肉進(jìn)行鑒定,即使樣品在115 ℃中加熱2 h,使用熒光PCR方法在樣品中也可以檢測(cè)到低至0.1%含量的豬肉。科學(xué)家利用實(shí)時(shí)熒光PCR研發(fā)了多種定量方法。Mendozaromero等[32]實(shí)現(xiàn)了基于實(shí)時(shí)熒光PCR方法的反芻動(dòng)物的相對(duì)定量,能夠最低檢測(cè)到10 tg的牛DNA。Kim等[33]利用D環(huán)區(qū)設(shè)計(jì)引物,可以最低檢測(cè)出0.1 pg的豬DNA。Xiang等[34]從細(xì)胞核DNA中找到了細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白基因,并驗(yàn)證了其特異性,定量檢測(cè)限為10 pg。Druml等[35]開發(fā)了鹿的熒光PCR方法,在混合肉的實(shí)驗(yàn)中效果良好,定量限小于0.5%。Furutani等[36]利用特制的便攜式熒光PCR裝置,可以在16 min內(nèi)完成45個(gè)循環(huán)的熒光PCR反應(yīng),準(zhǔn)確高效的檢測(cè)出食品中的豬、牛、雞等物種。這個(gè)方法一定程度解決了監(jiān)管部門在現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)的需求。劉艷艷等[37]將多重PCR與實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)合起來,綜合利用細(xì)胞核DNA和線粒體DNA設(shè)計(jì)了三對(duì)引物和五種探針,采用多重?zé)晒釶CR方法在一輪PCR中可以同時(shí)區(qū)分出驢肉、馬肉和騾肉。實(shí)時(shí)熒光定性PCR是現(xiàn)在肉類鑒定中最主要的方法之一,其相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法眾多。

6 數(shù)字PCR方法

數(shù)字PCR技術(shù)誕生于1999年,2003年發(fā)明了BEAMing技術(shù)[38],在此基礎(chǔ)上于2006年發(fā)明了基于芯片法的數(shù)字PCR儀,2011年發(fā)明了基于微滴法的數(shù)字PCR儀[39]。數(shù)字PCR將基因樣品分散到大量的獨(dú)立反應(yīng)空間中,每個(gè)空間中含有大約一個(gè)基因拷貝,利用模板特異性引物探針來檢測(cè)PCR的最終產(chǎn)物,在對(duì)所有空間進(jìn)行PCR反應(yīng)后,利用計(jì)數(shù)器測(cè)量PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度,通過泊松統(tǒng)計(jì)分析得到數(shù)據(jù)?，F(xiàn)在主要有兩種數(shù)字PCR技術(shù):芯片式數(shù)字PCR(chip digital PCR,cdPCR)和微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)。與實(shí)時(shí)熒光PCR的相對(duì)定量所不同,利用數(shù)字PCR反應(yīng)可以對(duì)樣品進(jìn)行絕對(duì)定量分析,消除本底信號(hào)的干擾。Scollo等[40]對(duì)數(shù)字PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR具有更好的分辨率。

Floren等[41]利用基因組DNA與線粒體DNA分別設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行動(dòng)物源性成分的定量檢測(cè),通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)線粒體DNA在不同的細(xì)胞組織中含量分布不均勻,不適用于定量分析,而基因組DNA在不同的細(xì)胞組織中含量恒定,適用于定量分析。因此針對(duì)數(shù)字PCR的定量需求,需要對(duì)不同物種開發(fā)基于基因組DNA的新引物探針。苗麗等[42]利用單拷貝基因?qū)悠分械难蜻M(jìn)行定量分析,成功建立了拷貝數(shù)與DNA濃度,DNA濃度與樣品質(zhì)量的關(guān)系式,可以達(dá)到絕對(duì)定量的要求,檢測(cè)低限達(dá)到10%。任君安等[43]利用數(shù)字PCR測(cè)得羊與豬的拷貝數(shù)比率,并與實(shí)際樣品中,羊和豬的質(zhì)量比率進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)可以最低檢測(cè)出1%的豬肉。數(shù)字PCR作為一種新型PCR方法,在定量應(yīng)用中有著廣闊的前景,可以區(qū)分有意摻假和無意沾染。對(duì)于深加工的肉制品理論上可以做到精確定量,滿足監(jiān)管的需求。表1總結(jié)了國(guó)內(nèi)外利用數(shù)字PCR對(duì)肉制品檢測(cè)的現(xiàn)狀。

表1 數(shù)字PCR對(duì)肉制品檢測(cè)的定量限Table 1 Limit in meat adulteration detection by digital PCR

7 DNA條形碼技術(shù)

現(xiàn)今的大多數(shù)檢測(cè)方法并沒有實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)性和標(biāo)準(zhǔn)化,不同監(jiān)管部門可能使用不同的基因來鑒別同一種物種,這不利于監(jiān)管的科學(xué)化管理。加拿大科學(xué)家Hebert[49]于2003年提出了DNA條形碼技術(shù)。DNA條形碼技術(shù)是一種利用短的DNA序列對(duì)物種進(jìn)行鑒別的技術(shù),現(xiàn)今大部分動(dòng)物采用COI基因作為條形碼標(biāo)準(zhǔn)片段[50]。李新光等[51]利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)15種烤魚片進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)僅有一種烤魚片與包裝標(biāo)識(shí)相符,因此市場(chǎng)中存在大量的造假行為。Cardeosa等[52]在廣州的市場(chǎng)上采購了200種鯊魚魚鰭,這些魚鰭中只有0.5%含有完整的COI序列,但是最終利用DNA條形碼技術(shù)仍然能夠成功鑒別其中的170種魚鰭的種屬,其余30種由于其擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量較差,導(dǎo)致了鑒別的失敗。Vartak等[53]利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)11種食用蟹進(jìn)行了成功的鑒別,發(fā)現(xiàn)在抽查的50份蟹肉樣品中,全部出現(xiàn)樣品與標(biāo)識(shí)不符,造假比率達(dá)到100%。DNA條形碼技術(shù)作為一種新型檢測(cè)技術(shù),對(duì)于監(jiān)管的標(biāo)準(zhǔn)化起到了重要的作用?，F(xiàn)在的研究主要在水產(chǎn)品方向,仍然需要在禽畜等方向進(jìn)行大量的研究。

8 結(jié)論與展望

目前,分子生物學(xué)檢測(cè)方法在肉類和肉制品的物種鑒定中得到廣泛的應(yīng)用。分子生物學(xué)檢測(cè)方法相比其他檢測(cè)方法有著巨大的優(yōu)勢(shì):核酸相比蛋白質(zhì)要更加穩(wěn)定;核酸在生物體內(nèi)大量存在,分布均勻;基于核酸方法的檢測(cè)成本更低、精確度更高;核酸在不同物種間具有更高的特異性。由于其他方法具有非常多的局限性,而分子生物學(xué)檢測(cè)的方法具有適用廣、精度高、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。因此分子生物學(xué)方法現(xiàn)在已經(jīng)逐漸成為物種鑒別領(lǐng)域的主要檢測(cè)方法。

在這些分子生物學(xué)檢測(cè)方法中,常規(guī)PCR和多重PCR方法是分子生物學(xué)檢測(cè)中最基礎(chǔ)的方法。RFLP方法具有較好的檢測(cè)效果,但可重復(fù)性差,因此較少應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)。DNA雜交技術(shù)存在有耗時(shí)長(zhǎng),靈敏度低等許多缺陷,因此較少應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)。目前實(shí)時(shí)熒光PCR方法逐漸成為了監(jiān)管應(yīng)用中的主角,其具有高效直觀靈敏度高的特點(diǎn)。但是這種方法也有一些不足之處,主要體現(xiàn)在檢測(cè)儀器昂貴,對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高,一般無法進(jìn)行快速檢測(cè)等方面。數(shù)字PCR、基因芯片技術(shù)和DNA條形碼技術(shù)仍需要進(jìn)一步的研究發(fā)展以滿足監(jiān)管需求。

在未來的研究中,分子生物學(xué)檢測(cè)方法可以向快速高效低成本的方向發(fā)展,完善優(yōu)點(diǎn)克服缺點(diǎn)?，F(xiàn)階段利用這些方法進(jìn)行定性檢測(cè)的研究已經(jīng)發(fā)展的比較成熟。未來應(yīng)該在定量檢測(cè)方面投入更多的研究精力,區(qū)分無意沾染和有意摻假是研究的新趨勢(shì)。在物種鑒別領(lǐng)域,這些分子生物學(xué)方法還有許多可以發(fā)展進(jìn)步的空間,科研工作者應(yīng)該繼續(xù)深入研究。