大豆異黃酮對褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)的體外研究

姜 秦，楊 寧，袁 瑞，陳京華，王正麗

( 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109 )

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)是我國主要的海水養(yǎng)殖魚類之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國北方大面積養(yǎng)殖。但隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，由于養(yǎng)殖密度高、投餌頻率增加及水體污染等原因，褐牙鲆感染疾病的幾率大大增加，病害問題已成為制約褐牙鲆養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸。探討免疫防治新途徑，提高魚體自身免疫力，是實(shí)現(xiàn)褐牙鲆健康養(yǎng)殖的可靠保障。而通過營養(yǎng)調(diào)控提高魚類的免疫力，已被證實(shí)是一種行之有效的方法[1]。

大豆異黃酮是來自大豆的主要植物雌激素[2]，是一種具有類雌激素性質(zhì)的抗?fàn)I養(yǎng)因子[3]，現(xiàn)有研究顯示，在陸生動物中，大豆異黃酮無論在體內(nèi)還是體外都具有免疫調(diào)節(jié)作用[4-6]。魚類中相關(guān)研究較少，有研究表明，飼料中添加低含量大豆異黃酮能夠促進(jìn)異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)生長[7]；飼料中添加適量的大豆異黃酮可以增強(qiáng)卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)免疫活性，降低死亡率[8]。但大豆異黃酮對褐牙鲆免疫效應(yīng)研究相對較少，國內(nèi)僅見大豆異黃酮對褐牙鲆免疫細(xì)胞功能的體外研究[9]。白細(xì)胞介素(IL)是由活化的單核——巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生的作用于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或者其他細(xì)胞的細(xì)胞因子[10]，在免疫活動中進(jìn)行信號傳遞、聯(lián)絡(luò)白細(xì)胞群等功能。免疫球蛋白(Ig)是蛋白質(zhì)的一種，在魚體受到外界刺激之后，由體內(nèi)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生[11]。免疫球蛋白的產(chǎn)生機(jī)制是在體內(nèi)接觸過曾經(jīng)對機(jī)體具有刺激作用的物質(zhì)之后，產(chǎn)生一種可以進(jìn)行抵抗的蛋白質(zhì)類抗體[12]。干擾素(IFN)由單核吞噬細(xì)胞高度分裂分化之后的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，通過干擾外來刺激物在體內(nèi)的分裂分化和結(jié)合過程，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[13]。熱休克蛋白(HSPs)是一種短期內(nèi)產(chǎn)生但具有高效作用的蛋白質(zhì)。熱休克蛋白的作用機(jī)制是與體內(nèi)免疫系統(tǒng)分泌的淋巴細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合，一起作用于外來物質(zhì)，起到免疫預(yù)防的功能[14]。本研究分離褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下，研究不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮對褐牙鲆4種免疫相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響，探討大豆異黃酮的免疫作用，以期為大豆異黃酮作為廉價(jià)的免疫增強(qiáng)劑提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用褐牙鲆購自日照某養(yǎng)殖場，體質(zhì)量(250±12) g，健康，活力好。暫養(yǎng)于水循環(huán)系統(tǒng)。暫養(yǎng)期間水溫17～19 ℃，鹽度32～40，溶解氧>8.0 mg/L，每日飽食投喂2次。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 頭腎巨噬細(xì)胞的分離

褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞的分離參考文獻(xiàn)[15]的方法。在無菌的條件下，剖取褐牙鲆頭腎，研磨并通過100目篩絹，將研磨液轉(zhuǎn)移到34%/51% Percoll分離液表層，4 ℃，2200 r/min離心25 min，吸取中間層巨噬細(xì)胞，加入吸取量3倍體積的0.15 mol/L磷酸緩沖鹽溶液，1200 r/min離心5 min，洗滌2次，加入2% FBS-L-15(雙抗1%)重懸細(xì)胞。用臺盼藍(lán)檢測調(diào)整細(xì)胞密度至2×107個(gè)/mL，按600 μL/孔接種到24孔板中，在20 ℃條件下，恒溫培養(yǎng)2 h使細(xì)胞貼壁備用。

1.2.2 頭腎巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)

頭腎巨噬細(xì)胞貼壁培養(yǎng)2 h后，用0.15 mol/L磷酸緩沖鹽溶液洗去未貼壁細(xì)胞，再分別加入大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的5%FBS-L-15細(xì)胞培養(yǎng)液，且每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行，放于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后6、12、24 h收集細(xì)胞，提取RNA。

添加脂多糖刺激時(shí)，吸棄未貼壁的細(xì)胞及培養(yǎng)液，分別加入大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0、1.0 mg/mL的5%FBS-L-15細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入脂多糖使其終質(zhì)量濃度為100 ng/mL，刺激1 h后，更換為不含脂多糖的大豆異黃酮細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)方法同上，分別在不含脂多糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3、6、12、24 h后收集細(xì)胞，提取RNA。

1.2.3 熒光定量PCR測定

吸棄培養(yǎng)液，收集貼壁細(xì)胞，然后采用Trizol法提取細(xì)胞RNA，按照康為世紀(jì)HiFiScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求合成第一鏈cDNA，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR。以-actin為內(nèi)參基因，RT-PCR反應(yīng)體系及過程參照Takara PrimeScript熒光定量試劑盒。引物序列見表1。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得Ct值采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因在不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮培養(yǎng)下的相對表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan多重比較，P<0.05表示差異顯著。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 大豆異黃酮體外對褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞IL-1相對表達(dá)量的影響

研究結(jié)果顯示，大豆異黃酮在體外能夠顯著促進(jìn)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞的IL-1基因相對表達(dá)(P<0.05)，且促進(jìn)作用隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增強(qiáng)(圖1)。用添加大豆異黃酮的培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h后，0.5、1.0、1.5 mg/mL質(zhì)量濃度組的IL-1基因相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)；培養(yǎng)12 h后，添加大豆異黃酮試驗(yàn)組的IL-1基因相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.05)，且1.0、1.5 mg/mL試驗(yàn)組顯著高于其他大豆異黃酮添加組；至24 h，大豆異黃酮質(zhì)量濃度不低于0.5 mg/mL各試驗(yàn)組IL-1的相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，且1、1.5 mg/mL試驗(yàn)組的IL-1基因相對表達(dá)量最高。即在試驗(yàn)梯度范圍內(nèi)，培養(yǎng)液中大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5～1.5 mg/mL時(shí)，能夠顯著增強(qiáng)IL-1基因的相對表達(dá)量。

2.2 大豆異黃酮體外對褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞IFN-相對表達(dá)量的影響

圖1 大豆異黃酮對褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞IL-1的影響不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同.

圖2 大豆異黃酮對褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞IFN-的影響

2.3 大豆異黃酮體外對褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞IgM相對表達(dá)量的影響

離體條件下大豆異黃酮能夠顯著增強(qiáng)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞IgM基因相對表達(dá)(P<0.05)(圖3)。培養(yǎng)6 h后，培養(yǎng)液中添加0.5、1.0 mg/mL大豆異黃酮試驗(yàn)組的IgM基因相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)；培養(yǎng)12 h后，大豆異黃酮為1.0、1.5 mg/mL試驗(yàn)組的IgM基因相對表達(dá)量顯著高于對照組及其他各組(P<0.05)；至24 h后，0.5、1.0 mg/mL大豆異黃酮試驗(yàn)組的褐牙鲆IgM基因相對表達(dá)量顯著高于對照組和其他各組(P<0.05)。即在試驗(yàn)梯度范圍內(nèi)，培養(yǎng)液中大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg/mL時(shí)，在體外能夠顯著增強(qiáng)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞IgM基因的相對表達(dá)量。

圖3 大豆異黃酮對褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞IgM的影響

2.4 大豆異黃酮體外對褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞HSP70相對表達(dá)量的影響

離體條件下，培養(yǎng)液中大豆異黃酮能夠顯著增強(qiáng)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞HSP70基因相對表達(dá)(P<0.05)(圖4)。培養(yǎng)6 h和12 h后，大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL及以上試驗(yàn)組褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞中HSP70基因的相對表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05)；至24 h后，大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5 mg/mL的試驗(yàn)組HSP70的相對表達(dá)量顯著高于對照組和其他各添加組(P<0.05)。即在試驗(yàn)梯度范圍內(nèi)，體外培養(yǎng)液中大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5～1.5 mg/mL時(shí)，能夠顯著增強(qiáng)頭腎巨噬細(xì)胞HSP70基因的相對表達(dá)量。

圖4 大豆異黃酮對褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞HSP70的影響

2.5 脂多糖刺激下大豆異黃酮離體對褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)基因的影響

研究結(jié)果顯示，在脂多糖刺激后，添加1.0 mg/mL大豆異黃酮培養(yǎng)的褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞4種免疫相關(guān)基因隨刺激后培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢與未添加大豆異黃酮組基本一致，但是在某些時(shí)間點(diǎn)，其相對表達(dá)量顯著增加。在脂多糖刺激后繼續(xù)培養(yǎng)6、24 h時(shí)，大豆異黃酮添加組的褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞的IL-1基因表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.01)；脂多糖刺激后繼續(xù)培養(yǎng)24 h時(shí)，大豆異黃酮添加組IFN-基因的表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)；IgM基因則在6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.01)；而大豆異黃酮添加組的HSP70基因自脂多糖刺激繼續(xù)培養(yǎng)3 h開始，其相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.01)。

3 討 論

褐牙鲆的頭腎巨噬細(xì)胞是固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞，在機(jī)體免疫防御過程中起重要作用。IL-1、IFN-、IgM和HSP70是4種比較典型的免疫相關(guān)基因，均在褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞中表達(dá)，因此本試驗(yàn)選擇離體條件下用不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮培養(yǎng)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞，在不同時(shí)間測定上述4種基因的相對表達(dá)量，以此探討大豆異黃酮與免疫的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，大豆異黃酮能夠顯著影響這4種基因的相對表達(dá)，且不同基因在大豆異黃酮不同質(zhì)量濃度、不同作用時(shí)間均存在顯著差異。

脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分之一，具有很強(qiáng)的免疫原性，可以調(diào)控細(xì)胞的信號通路，影響相關(guān)基因的表達(dá)[20]。李勝亮等[21]研究顯示，脂多糖刺激可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞IL-1釋放增多；于東云等[22]研究顯示，HSP70在脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中應(yīng)激表達(dá)，認(rèn)為HSP70對肺損傷起保護(hù)作用。本研究在脂多糖刺激條件下，比較研究含1.0 mg/mL大豆異黃酮組與不含大豆異黃酮的對照組的免疫基因表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂多糖刺激后，4種基因表達(dá)隨時(shí)間變化而變化，而添加質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL大豆異黃酮組與對照組的變化趨勢基本一致。但是試驗(yàn)組IL-1基因表達(dá)在6 h和24 h顯著高于對照組；IFN-基因在24 h顯著高于對照組；IgM基因在6 h顯著高于對照組；而HSP70基因自3 h開始均顯著高于對照組。這些變化表明，在受到免疫刺激的情況下，大豆異黃酮可以提高IL-1、IFN-、IgM和HSP70基因的相對表達(dá)量，可能提高機(jī)體免疫力。

綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，培養(yǎng)液中大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5～1.5 mg/mL時(shí)，能夠顯著上調(diào)體外培養(yǎng)條件下褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞IL-1、IFN-、IgM和HSP70基因的相對表達(dá)，從而增強(qiáng)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞的免疫力。