丁媛媛,弓曉娟,劉洋,高藝芳,路雯婧,焦媛,董川*

(1.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 環(huán)境科學(xué)研究所,山西 太原 030006)

0 引言

碳量子點是繼富勒烯,碳納米管以及石墨烯之后出現(xiàn)的一種新型碳納米材料,是一種尺寸在10 nm以下的碳納米顆粒[1]。與傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點和有機(jī)染料相比,碳量子點具有良好的水溶性和分散性[2]、強(qiáng)光穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性[3]、易于表面修飾和功能化[4]及良好的生物相容性和低毒性[5]等優(yōu)異的特性,使其在生物成像[6]、化學(xué)傳感[7]、藥物遞送[8]等方面引起研究者的廣泛興趣。然而,目前報道的碳大多呈現(xiàn)藍(lán)色或綠色熒光,無法避免細(xì)胞中生物基質(zhì)自體熒光的干擾,同時也會對細(xì)胞造成一定程度上的光損傷,使其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用受到限制[4,9-11]。因此,研制具有長發(fā)射波長的碳量子點是迫切需要的。

目前,碳量子點發(fā)光機(jī)制尚不明確,合成長發(fā)射波長的碳量子點具有挑戰(zhàn)性[10,12]。一些研究表明[7,13-15],氮摻雜是提高碳量子點發(fā)光性能的有效途徑。Lin等[16]通過氮元素?fù)诫s的方法合成出紅色碳量子點,并提出高的氮元素含量和尺寸效應(yīng)是影響長波長發(fā)射的關(guān)鍵因素;Jiang等[7]制備了氮摻雜的黃色熒光碳量子點并將其應(yīng)用于細(xì)胞成像以及多功能傳感;Ding等[10]合成出氮摻雜的紅色熒光碳量子點并將其成功用于小鼠的體內(nèi)成像和體外細(xì)胞成像。然而,大多數(shù)長波長碳量子點的制備需要經(jīng)過復(fù)雜的柱色譜分離純化過程。本文以對苯二胺為前驅(qū)體,通過簡便的一步微波法合成得到高量子產(chǎn)率的橘色熒光碳量子點N-CDs,對其進(jìn)行表征和相關(guān)性能研究,并用于細(xì)胞成像分析。研究表明N-CDs具有優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)和良好的生物相容性,在細(xì)胞成像方面具有潛在的應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

試劑:對苯二胺,氯化鈉,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉及羅丹明B購自阿拉丁試劑公司,乙二胺和無水乙醇購自天津市福晨化學(xué)試劑廠,均為分析純試劑。實驗用水為二次蒸餾水。

儀器:JEM-2100場發(fā)射透射電子顯微鏡(JEOL,日本電子光學(xué)公司);Lambda 365 紫外可見分光光度計(美國PerkinElmer),CARY-Eclipse 熒光分光光度計(美國VARIAN公司); Tensor-27 紅外光譜儀(德國Bruker公司);AXIS ULTRA DLD型 X-射線光電子能譜儀(英國Kratos公司);SunRise型酶標(biāo)儀(奧地利Tecan Austria GmbH公司);FE20酸度計(瑞士METTLER TOLEDO公司);G70D20CN1P-D2(S0)微波爐(中國Galanz公司)

1.2 N-CDs的合成方法

首先,準(zhǔn)確稱取0.2 g對苯二胺置于100 mL燒杯中,加入5 mL乙二胺,用玻璃棒充分?jǐn)嚢柚敝翆Ρ蕉吠耆芙庥谝叶啡芤褐?將燒杯置于微波爐中,以500 W的功率反應(yīng)20 min,反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。其次,用孔徑為0.2 μm濾膜過濾反應(yīng)所得到的溶液,并將其置于500～1 000 Da的透析袋透析純化48 h以去除未反應(yīng)的小分子原料。最后,將透析所得溶液進(jìn)一步冷凍干燥,得到淺紫色的絮狀粉末。

1.3 熒光量子產(chǎn)率的測定

采用相對量子產(chǎn)率測定的方法[17],以羅丹明B的乙醇溶液作為參比溶液,通過測量碳點稀溶液和羅丹明B稀溶液在同一激發(fā)波長下的積分熒光強(qiáng)度和該激發(fā)波長下的吸光度值(吸光度均小于 0.1),然后按下列公式計算碳點的熒光量子產(chǎn)率:

其中?表示所需測試樣品的量子產(chǎn)率,I表示測試樣品的積分熒光強(qiáng)度,n表示折射率(水溶液中為1.33,乙醇溶液中為1.36),A表示吸光度,帶有符號(′)表示所選參比的各個物理量。為得到更準(zhǔn)確的測量結(jié)果,通過改變羅丹明B和所測碳點的濃度,分別測量一系列濃度下495 nm處的吸光度值(0-0.1)及相應(yīng)的積分熒光強(qiáng)度。最終通過比較以積分熒光強(qiáng)度和吸光度作為變量的直線的斜率來確定樣品的熒光量子產(chǎn)率。

1.4 細(xì)胞毒性及細(xì)胞成像實驗

采用標(biāo)準(zhǔn)MTT法來測量N-CDs對肺腺癌A549細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。將A549細(xì)胞以1×104每孔接種于96孔板中,每孔體積100 μL37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,吸棄培養(yǎng)液。加入含有不同濃度的碳點的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)上清液,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min。酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度。

細(xì)胞成像實驗時,將肺腺癌A549細(xì)胞以1×105每孔接種于24孔板中培養(yǎng)24 h后,加入濃度為100 μg/mL的N-CDs溶液,繼續(xù)孵育4 h后,移除培養(yǎng)上清液,用pH為7.4的PBS緩沖溶液清洗3次后,于熒光顯微鏡下成像,觀察N-CDs進(jìn)入肺腺癌A549細(xì)胞后的成像情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳量子點的表征及性能研究

以0.2 g對苯二胺以及5 mL乙二胺分別以20%,40%,60%,80%和100%的功率進(jìn)行五組微波反應(yīng),其中每組以5 min,10 min,15 min,20 min為梯度進(jìn)行反應(yīng),得到20種反應(yīng)物,將反應(yīng)物冷卻至室溫,通過熒光光譜儀對反應(yīng)物的熒光性能進(jìn)行測定,測得在20%的功率下反應(yīng)20 min時,熒光性能優(yōu)異,且產(chǎn)率最高(13%)。通過TEM來表征N-CDs的表面形態(tài)和尺寸大小。如圖 1A所示,所制備的碳量子點呈現(xiàn)均勻的圓球形,且分散性良好,尺寸大小均一。圖 1B是通過測量 100 個碳量子點的粒徑,從而得到相應(yīng)的粒徑分布圖。由圖可知,粒徑的分布范圍在3.5～6.0 nm,平均粒徑約為5.8 nm,整體呈現(xiàn)正態(tài)分布。

Fig.1 Morphology and particle size of N-CDs. (A) TEM images; (B) Particle size distribution(A)N-CDs的掃描電鏡圖;(B)N-CDs的粒徑分布圖圖1 N-CDs的形貌和粒徑分布圖

Fig.2 Spectrum of N-CDs. (A) PL excitation and emission spectra of N-CDs. The inset displays photographs of the N-CDs under daylight (left) and UV irradiation (right) in aqueous solution.(B)UV-vis absorption spectra of N-CDs.(C) PL spectra of N-CDs at different excitation 400～550 nm. 1:400 nm, 2:420 nm,3:440 nm, 4:460 nm, 5:480 nm, 6:500 nm, 7:520 nm, 8:530 nm, 9:540 nm, 10:550 nm(A) N-CDs的最大激發(fā)和發(fā)射光譜圖。插圖為N-CDs的水溶液在日光下(左)和紫外(右)照射下的圖像；(B) N-CDs的紫外吸收光譜。(C) N-CDs在不同激發(fā)(400-590 nm)下的發(fā)射光譜圖。 1:400 nm, 2:420 nm, 3:440 nm,4:460 nm, 5:480 nm,6:500 nm, 7:520 nm, 8:530 nm, 9:540 nm, 10:550 nm圖2 N-CDs的光譜圖

圖2為N-CDs的熒光光譜圖。如圖2A所示,N-CDs的最佳激發(fā)波長為535 nm,對應(yīng)的發(fā)射波長為588 nm。N-CDs的水溶液在自然光下呈粉色透明澄清狀,而在紫外燈(365 nm) 下呈現(xiàn)明亮的橘色熒光。圖2B為N-CDs的紫外吸收光譜圖,由圖可知,N-CDs在200～600 nm處顯示出較寬的吸收,在245 nm處具有較強(qiáng)的特征吸收峰,這應(yīng)歸屬于C=C鍵的π-π*躍遷以及C-N鍵的n-π躍遷。圖2C為N-CDs在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜圖。由圖可知,當(dāng)激發(fā)波長從400 nm變化到550 nm時,N-CDs的發(fā)射光譜不會隨著激發(fā)光譜的改變而移動,具有一定的激發(fā)波長獨立性,反映出碳量子點表面的激發(fā)態(tài)的單一性。另外,以羅丹明B作為參比,測得N-CDs的量子產(chǎn)率為13%。

圖3(A)為N-CDs的傅里葉紅外光譜圖,如圖所示,3 308 cm-1處有明顯的吸收峰,與之對應(yīng)的是氨基基團(tuán)中N-H伸縮振動;1 574 cm-1和1 484 cm-1處有明顯的吸收峰,對應(yīng)苯環(huán)上C=C的伸縮振動;3 012 cm-1到2 861 cm-1附近寬的吸收峰對應(yīng)-CH2-的伸縮振動;1 183 cm-1處的吸收峰對應(yīng)-CO的伸縮振動。為進(jìn)一步了解N-CDs成分,對其進(jìn)行元素分析的表征,結(jié)果顯示,N-CDs由C,O,N,H四種元素構(gòu)成,其含量分別為43.00%, 20.60%, 28.19%, 6.21%。圖3(B)為N-CDs的X射線光電子能譜掃描圖(XPS),由圖可知,N-CDs由C,H,O,N四種元素構(gòu)成,與元素分析所得數(shù)據(jù)相一致。

Fig.3 (A) FTIR spectrum of N-CDs. (B) XPS survey scan of N-CDs圖3 (A) N-CDs的紅外光譜圖；(B) N-CDs的X射線光電子能譜掃描

圖4為N-CDs的高分辨率C 1s, N 1s和O 1s的X射線光電子能譜。如圖4(A)所示,N-CDs中碳元素主要有-CO-(288.11 eV),-C-N(285.48 eV)和C=C/C-C(284.42 eV)三種存在形式,在紅外光譜圖中也可找到相對應(yīng)的吸收,進(jìn)一步確定N-CDs中所包含的化學(xué)基團(tuán)。圖4(B)為N-CDs的N 1s的分峰光譜圖,N-CDs中氮元素主要有氨基類(399.57 eV),吡咯類(400.40 eV)和吡啶類(398.58 eV)三種存在形式,進(jìn)一步證明N-CDs含有豐富的氮元素,我們成功地將氮元素?fù)诫s到了碳量子點上。圖4(C)為N-CDs的O 1s的分峰光譜圖,氧元素主要有-C-O(330.70 eV)和-C=O(532.00 eV)兩種形式。

2.2 碳量子點的穩(wěn)定性研究

分別考察了N-CDs的離子穩(wěn)定性,光穩(wěn)定性,pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。采用測量N-CDs在一系列不同濃度的(0～1 mol/L)的NaCl溶液中的熒光光譜的方法來研究N-CDs的離子穩(wěn)定性。研究結(jié)果如圖5(A)所示,N-CDs在不同濃度的NaCl溶液中熒光強(qiáng)度較穩(wěn)定,當(dāng)NaCl溶液濃度最大達(dá)到1 mol/L時,熒光強(qiáng)度依然可達(dá)到原溶液強(qiáng)度的80%,顯示出優(yōu)良的抗鹽能力,具有良好的離子穩(wěn)定性。正常體液中生理鹽的濃度約為0.15 mol/L(質(zhì)量百分比為0.9%生理鹽水),因此,N-CDs完全可用于富含各種生理鹽的體液中。通過測量N-CDs溶液在氙燈長達(dá)100 min的不斷照射下以及在紫外燈長達(dá)180 min的照射下其熒光強(qiáng)度的變化來探究N-CDs的光穩(wěn)定性。結(jié)果如圖5(B)和圖5(C)所示,N-CDs溶液的熒光強(qiáng)度隨著氙燈的不斷照射呈現(xiàn)出非常微小的下降趨勢,其氙燈照射100 min后的熒光強(qiáng)度仍有最初強(qiáng)度的93%;N-CDs溶液在紫外燈的不斷照射下,熒光強(qiáng)度變化較小,180 min后的熒光強(qiáng)度為最初強(qiáng)度的91.5%。表明N-CDs具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性和抗光漂白性。通過檢測N-CDs在一系列不同pH值的PBS緩沖溶液中的熒光強(qiáng)度的變化來研究其pH穩(wěn)定性。結(jié)果如圖5(D)所示,N-CDs在不同pH值(1 ～ 13)的PBS緩沖溶液中熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱而后趨于平緩的趨勢,pH為3時熒光最強(qiáng),此后逐漸降低,pH至7時熒光強(qiáng)度不再降低,而后隨著pH的增大熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)較穩(wěn)定狀態(tài)。整體在酸性條件下呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是由于在酸性條件下,N-CDs表面氨基,亞氨基等基團(tuán)上氮原子的孤對電子易與氫離子結(jié)合,從而使N-CDs表面能級變寬、剛性結(jié)構(gòu)增強(qiáng)從而引起熒光發(fā)射強(qiáng)度的增加[18-19]。為進(jìn)一步研究N-CDs的熱穩(wěn)定性,對其進(jìn)行熱重分析(TGA),結(jié)果如圖5(E)所示,在N2保護(hù)下,當(dāng)溫度達(dá)到263℃時,N-CDs失重4.63%,為結(jié)合水的重量;當(dāng)溫度升高到320℃時,N-CDs大部分熱解,失重達(dá)到86.85%;當(dāng)溫度進(jìn)一步升高到520℃時,整體失重達(dá)98.53%。表明N-CDs具有良好的熱穩(wěn)定性。同時,通過測定N-CDs表面的Zata電位值,得出N-CDs表面的電位值為-8.64 mV,表面顯負(fù)電。一定的電荷使其在生物環(huán)境中既可兼顧粒子間的穩(wěn)定性,又能盡量保證其在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性。

Fig.4 High-resolution XPS C 1s, N 1s, and O 1s spectra of N-CDs.(A) C 1s XPS; (B) N 1s XPS; (C) N 1s XPS(A) N-CDs的C 1s X射線光電子能譜;(B) N-CDs的N 1s X射線光電子能譜;(C) N-CDs的O 1s X射線光電子能譜。圖4 N-CDs的高分辨率C 1s, N 1s和O 1s的X射線光電子能譜

Fig.5 Stability detection of N-CDs. (A)Fluorescence intensity of N-CDs at different concentration of NaCl;(B) Fluorescence intensity of N-CDs under continuously irradiated by xenon lamp;(C) Fluorescence intensity of N-CDs under continuously irradiated by UV;(D) Fluorescence intensity of N-CDs under different pH;(E)TGA curves of N-CDs(A) N-CDs在不同鹽離子濃度下的熒光發(fā)射強(qiáng)度;(B) N-CDs被氙燈持續(xù)照射時的熒光發(fā)射強(qiáng)度變化;(C)N-CDs被UV燈持續(xù)照射時的熒光發(fā)射強(qiáng)度變化;(D) N-CDs在不同pH下的熒光發(fā)射強(qiáng)度;(E)N-CDs的熱重分析圖圖5 N-CDs的穩(wěn)定性檢測

2.3 碳量子點的細(xì)胞毒性和成像研究

采用標(biāo)準(zhǔn)MTT法來測量N-CDs對肺腺癌A549細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。圖 6 為不同濃度的N-CDs溶液(0 ～ 100 μg/mL) 孵育 A549 細(xì)胞 24 h 后的實驗結(jié)果,由圖可知,當(dāng)N-CDs濃度高達(dá) 100 μg/mL時,肺腺癌A549 細(xì)胞的存活率依然保持在80%以上。結(jié)果表明N-CDs具有較低的細(xì)胞毒性,這一性質(zhì)使其在細(xì)胞成像,生物標(biāo)記等方面具有潛在應(yīng)用。

圖7為肺腺癌A549細(xì)胞在濃度為100 μg/mL的N-CDs溶液環(huán)境下孵育4 h后,通過514 nm激光激發(fā),激光共聚焦掃描顯微鏡下的成像結(jié)果(A為暗場成像結(jié)果;B為明場成像結(jié)果;C為明暗場疊加成像結(jié)果)。如圖7A所示,細(xì)胞發(fā)出橘色熒光,表明N-CDs能輕易透過A549細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)從而呈現(xiàn)出明亮的橙色熒光,說明N-CDs具有良好的細(xì)胞膜通透性和生物相容性,在生物成像領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

Fig.6 Cytotoxic effects of different concentrations N-CDs on A549 cells圖6 不同濃度的N-CDs對A549細(xì)胞的毒性實驗結(jié)果

Fig.7 Confocal fluorescence image of N-CDs under 514 nm laser excitation of A549 cells(A) Dark fieldimage; (B) Bright field image; (C) Merged image of Brightanddark field image(A)暗場圖;(B)明場圖;(C)明場和暗場疊加圖圖7 N-CDs在A549細(xì)胞中以514 nm激光激發(fā)下的共聚焦熒光圖像

3 結(jié)論

本研究以對苯二胺為前驅(qū)體,以氮摻雜的方式,通過簡便的一步微波法制備出一種新型橘色熒光碳量子點(N-CDs),制備方法簡便易行,無須經(jīng)過柱色譜分離過程。所獲得的碳點具有長波長發(fā)射,優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì),良好的水溶性,光穩(wěn)定性,生物相容性及低毒性等優(yōu)點,并將其成功用于肺腺癌A549細(xì)胞的熒光成像,為長波發(fā)射的熒光碳點應(yīng)用于細(xì)胞成像提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。