響應(yīng)面法優(yōu)化羊肚菌可溶性膳食纖維提取工藝

王芳，楊飄，盧會(huì)敏，張碩，劉松青

(成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，成都 611130)

膳食纖維，目前已被列為繼蛋白質(zhì)、脂肪、水、礦物質(zhì)、維生素、碳水化合物之后的“第七類營(yíng)養(yǎng)素”[1]，其中的可溶性膳食纖維(SDF)具有預(yù)防心血管疾病，降低血脂、血糖、膽固醇，減少糖尿病和腫瘤發(fā)生等功效[2,3]，被廣泛應(yīng)用于烘焙食品、飲料、湯料、調(diào)味品及果凍制品生產(chǎn)中[4,5]，應(yīng)用前景較好。

羊肚菌作為近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用于一體的珍惜真菌新品種，已備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[6-10]。其子實(shí)體含豐富的膳食纖維[11,12]，便于開發(fā)功能性新型食品，增加羊肚菌殘品的利用率。然而，現(xiàn)有報(bào)道鮮見從羊肚菌中提取可溶性膳食纖維的研究。目前， SDF提取方法主要有化學(xué)法[13]、發(fā)酵法[14]、超聲波提取法等[15]，其中化學(xué)法應(yīng)用較為成熟，具有成本低、易操作、適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)以羊肚菌為原料，采用化學(xué)法提取羊肚菌可溶性膳食纖維，利 用單因素和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳提取工藝，為羊肚菌的綜合利用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊肚菌：由四川北川神農(nóng)有限責(zé)任公司提供。

1.2 儀器、試劑

FK-A組織搗碎機(jī) 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；DHG-9123A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JA3003精密電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；SC-3610低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HWS12恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；JH-ZLS-3真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀 上海申光儀器儀表有限公司；pHSJ-4F 上海雷磁精密酸度計(jì) 儀電科學(xué)儀器股份有限公司。氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇：分析純?cè)噭?/p>

1.3 方法

1.3.1 羊肚菌可溶性膳食纖維的提取工藝流程

羊肚菌→粉碎過篩→NaOH溶液提取→水浴→離心→濾渣→二次浸提→合并濾液→鹽酸調(diào)節(jié)pH值→濃縮→抽濾→醇沉→水洗→烘干→羊肚菌可溶性膳食纖維(SDF)。

1.3.2 羊肚菌可溶性膳食纖維的提取工藝要點(diǎn)

堿提：準(zhǔn)確稱取羊肚菌粉于試管中，加入一定濃度的氫氧化鈉溶液，放置恒溫水浴鍋中堿提，離心，分離上清液和濾渣。

濃縮：真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)合并的上清液，溫度調(diào)節(jié)為60 ℃，真空度為0.08 MPa。

醇沉：將蒸發(fā)濃縮的上清液按與乙醇1∶4進(jìn)行沉淀，離心處理，用蒸餾水將離心所得沉淀物復(fù)溶至20 mL，再重復(fù)用乙醇沉淀，最終離心得沉淀物為可溶性膳食纖維。

1.3.3 可溶性膳食纖維得率計(jì)算

將可溶性膳食纖維得率作為最終評(píng)定指標(biāo)，每個(gè)處理重復(fù)平行3次?？扇苄陨攀忱w維得率=m1/m2×100%，式中：m1為提取的羊肚菌SDF的質(zhì)量，g；m2為稱取的羊肚菌粉的質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 料液比對(duì)羊肚菌SDF得率的影響

選取料液比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，堿液濃度為1%，溫度為70 ℃，浸提時(shí)間為60 min，以得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究料液比對(duì)羊肚菌SDF得率的影響。

1.3.4.2 堿液濃度對(duì)羊肚菌SDF得率的影響

選取提取液的濃度分別為0.5%，0.75%，1%，1.25%，1.5%，料液比為1∶20，溫度為70 ℃，浸提時(shí)間為60 min，以得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究浸提液的濃度對(duì)羊肚菌SDF得率的影響。

1.3.4.3 提取溫度對(duì)羊肚菌SDF得率的影響

選取溫度為60，70，80，90，100 ℃，堿液濃度為1%，料液比1∶20，浸提時(shí)間60 min，以得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究提取溫度對(duì)羊肚菌SDF得率的影響。

1.3.4.4 提取時(shí)間對(duì)羊肚菌SDF得率的影響

選取提取時(shí)間為30，60，90，120，150 min，堿液濃度為1%，料液比為1∶20，提取溫度為70 ℃，以得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究提取時(shí)間對(duì)羊肚菌SDF得率的影響。

1.3.5 羊肚菌可溶性膳食纖維響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型。對(duì)影響羊肚菌SDF得率的4個(gè)因素，即料液比(X1)、浸提液濃度(X2)、提取溫度(X3)、提取時(shí)間(X4)進(jìn)行考察，設(shè)計(jì)因素水平表，見表1。所得試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌SDF制備工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)羊肚菌SDF得率的影響

料液比對(duì)羊肚菌SDF得率的影響，見圖1。

圖1 料液比對(duì)SDF得率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratios on SDF yield

由圖1可知，料液比對(duì)SDF得率具有一定的影響，料液比在1∶10～1∶20 (g/mL)之間時(shí)，羊肚菌SDF得率顯著升高，在1∶20 (g/mL)時(shí)SDF得率達(dá)到最大值。當(dāng)料液比在1∶20～1∶30 (g/mL)時(shí)，羊肚菌SDF得率增加量開始減少。這是由于在適當(dāng)料液比范圍內(nèi)，料液比的增加可以增強(qiáng)SDF的溶出，但料液比超過某一值時(shí)，堿液的濃度稀釋降低了羊肚菌SDF的提取效果，綜合經(jīng)濟(jì)及后續(xù)試驗(yàn)處理的工作量考慮，采用料液比1∶20左右較為適宜。

2.1.2 堿液濃度對(duì)羊肚菌SDF得率的影響

堿液濃度對(duì)羊肚菌SDF得率的影響，見圖2。

圖2 堿液濃度對(duì)SDF得率的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on SDF yield

由圖2可知，堿液濃度在0.5%～1.25%之間時(shí)，羊肚菌SDF得率隨提取液濃度的增加而增大；在1.25%時(shí)SDF得率達(dá)到最大值；當(dāng)堿液濃度超過1.25%時(shí)，SDF得率開始下降。羊肚菌SDF在堿液條件下溶解，與膳食纖維反應(yīng)生成堿纖維素[16]，致使羊肚菌SDF得率降低。因此，綜合產(chǎn)品得率和經(jīng)濟(jì)效益，選擇堿液濃度為1.25%更有利于羊肚菌SDF的提取。

2.1.3 提取溫度對(duì)羊肚菌SDF得率的影響

提取溫度對(duì)羊肚菌SDF得率的影響，見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)SDF得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperatures on SDF yield

由圖3可知，提取溫度在60～70 ℃時(shí)，隨溫度升高，羊肚菌SDF得率持續(xù)升高；在70 ℃時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)溫度在70～100 ℃時(shí)，隨溫度升高，羊肚菌SDF得率顯著下降。分析原因可能是溫度過高破壞了SDF分子結(jié)構(gòu)中的氫鍵，導(dǎo)致其得率降低[17]。因此，最適提取溫度為70 ℃。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)羊肚菌SDF得率的影響

提取時(shí)間對(duì)羊肚菌可溶性膳食纖維得率的影響，見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)SDF得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on SDF yield

由圖4可知，提取時(shí)間在30～60 min之間時(shí)，羊肚菌SDF得率隨時(shí)間的增加而升高。當(dāng)提取時(shí)間大于90 min之后時(shí)，羊肚菌SDF得率呈平穩(wěn)趨勢(shì)。這可能是由于SDF中的鏈結(jié)合是依賴于氫鍵實(shí)現(xiàn)的，相當(dāng)牢固，通過化學(xué)作用斷裂的時(shí)間較長(zhǎng)。但若提取時(shí)間過久，SDF可能會(huì)發(fā)生裂解、解酯而降低提取效率[18]。因此，最佳提取時(shí)間為90 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取羊肚菌SDF 提取工藝

為了獲得羊肚菌SDF的最佳提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比(X1)、堿液濃度(X2)、提取溫度(X3)、提取時(shí)間(X4)4個(gè)因素為自變量，以羊肚菌SDF得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.6 軟件中的Box-Behnken模型，建立回歸方程，對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis for response surface regression model

續(xù) 表

注：“*”為P<0.05；“**”為P<0.01；“***”為P<0.001。

2.2.1 羊肚菌SDF提取工藝模型建立與顯著性檢驗(yàn)

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型的P值<0.0001，說明該數(shù)學(xué)模型極為顯著；失擬項(xiàng)值為0.6757，差異不顯著，表明該方程對(duì)試驗(yàn)的擬合度較好，可用來確定羊肚菌SDF制備的最佳工藝。對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立回歸方程：Y=31.77-1.60X1-1.55X2-2.06X3-0.43X4-1.06X1X2+0.18X1X3-0.83X1X4-0.17X2X3+2.44X2X4+0.25X3X4-3.18X12-1.83X22-1.47X32-0.51X42。

式中：Y為可溶性膳食纖維得率；X1，X2，X3，X4分別為料液比、堿液濃度、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)自變量的編碼值。

表3中，影響羊肚菌SDF得率因素的F值可以反映該因素對(duì)試驗(yàn)影響的大小，F(xiàn)越大表明該因素對(duì)試驗(yàn)影響越大。X1，X2，X3，X4的F值分別為18.22，17.05，30.08，1.31，因此影響SDF得率的主次因素為：提取溫度>料液比>堿液濃度>提取時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

為研究試驗(yàn)因素交互作用對(duì)羊肚菌SDF提取效果的影響，可以通過響應(yīng)面分析實(shí)現(xiàn)。通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，所得的響應(yīng)面圖見圖5～圖10。

圖5 料液比與堿液濃度響應(yīng)面Fig.5 Interactive effect of solid-liquid ratio and NaOH concentration on yield of SDF

圖6 料液比與提取溫度響應(yīng)面Fig.6 Interactive effect of solid-liquid ratio and extraction temperature on yield of SDF

圖7 料液比與提取時(shí)間響應(yīng)面Fig.7 Interactive effect of solid-liquid ratio and extraction time on yield of SDF

圖8 堿液濃度與提取溫度響應(yīng)面Fig.8 Interactive effect of NaOH concentration and extraction temperature on yield of SDF

圖9 堿液濃度與提取時(shí)間響應(yīng)面Fig.9 Interactive effect of NaOH concentration and extraction time on yield of SDF

圖10 提取溫度與提取時(shí)間響應(yīng)面Fig.10 Interactive effect of extraction temperature and extraction time on yield of SDF

由圖5、圖6、圖8可知，羊肚菌SDF得率隨堿液濃度、料液比、提取溫度的增大，響應(yīng)值即羊肚菌SDF得率增大。當(dāng)其達(dá)到極值后，又因各因素值的增加，響應(yīng)值下降。因素之間的交互作用不顯著；由圖7可知，SDF得率隨料液比的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大，兩因素有交互作用，但不顯著；由圖9可知，SDF得率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而降低，隨堿液濃度變化為先增大后減少。兩因素對(duì)SDF得率的影響極顯著，與方差分析結(jié)果相一致。由圖10 可知，SDF得率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而增加，隨提取溫度為先增加后逐漸減少，其交互作用不顯著。影響提取羊肚菌SDF的單因素方面為X3>X1>X2>X4，即提取溫度>料液比>提取液濃度>提取時(shí)間。溫度、料液比、堿液濃度對(duì)提取羊肚菌SDF的影響都是極顯著的，所以在制備羊肚菌SDF時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制好這些因素。

2.2.3 工藝優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析優(yōu)化，可得到羊肚菌SDF最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶20.12 (g/mL)、 堿液濃度0.75%、提取溫度62.79 ℃、提取時(shí)間60 min。在此最佳工藝提取條件下，SDF理論得率為 34.62%。考慮到試驗(yàn)可操作性，將制備的最優(yōu)條件定為料液比1∶20(g/mL)、提取液濃度0.75%、提取溫度63 ℃、提取時(shí)間 60 min。在此制備條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到羊肚菌SDF的平均值為33.06%，與模型得出的羊肚菌SDF理論值比較接近，說明數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化羊肚菌SDF的提取工藝是可行的。

3 結(jié)論

本研究采用堿法提取羊肚菌中可溶性膳食纖維，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到各因素對(duì)羊肚菌SDF得率的影響順序?yàn)椋禾崛囟?料液比>堿液濃度>提取時(shí)間；提取的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶20 (g/mL)、提取液濃度0.75%、提取溫度63 ℃、提取時(shí)間60 min，在此工藝條件下羊肚菌SDF得率為33.06%。本試驗(yàn)為綜合利用羊肚菌資源研究奠定了理論基礎(chǔ)。