橋粒芯蛋白2在膽管癌中的表達(dá)及其臨床意義△

于佳汝，姚雪卿，李凌，梁哲龍

1延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，吉林 延邊133000

2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系麻醉教研室，吉林 延邊133000

膽管癌是消化系統(tǒng)較為常見的惡性腫瘤之一，起源于膽管上皮細(xì)胞。目前，膽管癌患者的術(shù)后5年生存率仍較低，預(yù)后較差[1]。影響膽管癌患者預(yù)后的主要危險(xiǎn)因素是膽管癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，并且膽管癌患者早期缺乏典型的臨床癥狀，難以被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者明確診斷時(shí)已屬于進(jìn)展期，失去了外科手術(shù)的指征，因此，患者預(yù)后較差。臨床上常見患者發(fā)病后幾個(gè)月即因發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而發(fā)生死亡[2]。因此，膽管癌的診治一直是消化系統(tǒng)腫瘤領(lǐng)域中引起高度重視的問題。目前，臨床上常規(guī)使用糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）作為膽管癌診斷和預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物，但特異度和敏感度均較低。因此，近年來的研究著重于尋找膽管癌早期診斷和預(yù)后判斷的特異性分子標(biāo)志物。橋粒是上皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞特有的一種細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)，文獻(xiàn)提示缺失橋粒粘著是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）發(fā)生的先決條件，牽涉到早期癌向浸潤(rùn)癌轉(zhuǎn)換[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中構(gòu)成橋粒的組成蛋白表達(dá)異常，并可破壞細(xì)胞間橋粒，發(fā)生一系列變化進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。橋粒芯糖蛋白2（desmoglein 2，DSG2）是構(gòu)成細(xì)胞間橋粒的主要成分[5]，除與天皰瘡等自身免疫疾病和家族性心律失常性右心室發(fā)育不良等遺傳性疾病密切相關(guān)外[6]，在惡性腫瘤中也起重要的作用。研究表明，低表達(dá)DSG2表型是一個(gè)有用的侵襲性前列腺癌預(yù)后生物學(xué)指標(biāo)[7]。然而，DSG2在膽管癌組織中的表達(dá)的研究目前尚缺乏明確的研究數(shù)據(jù)。本研究主要探討DSG2在膽管癌組織中的表達(dá)情況，并分析DSG2的表達(dá)與患者臨床特征和存活率的關(guān)系，旨在評(píng)估其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2010年1月至2012年1月于延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院就診的141例膽管癌患者作為研究對(duì)象。選取141例膽管癌患者的腫瘤組織標(biāo)本及40例癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣＞2 cm）。141例患者中，男75例，女66例；＜60歲77例，≥60歲64例；TNM分期：I～Ⅱ期患者91例，Ⅲ～Ⅳ期患者50例；腺癌136例，乳頭狀腺癌3例，鱗癌1例，腺鱗癌1例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡25～85歲；②初次確診；③均經(jīng)病理診斷確診為膽管癌；④肝腎功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受放化療患者；②合并其他腫瘤患者；③合并嚴(yán)重心肝腎基礎(chǔ)疾病患者；④拒絕參與本研究者。本研究經(jīng)延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，全部患者均對(duì)本研究知情同意，并自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 新鮮組織采集：于膽管癌切除術(shù)后1 h內(nèi)，收集病變組織及癌旁正常組織。蠟塊標(biāo)本的組織學(xué)類型，顯示大多數(shù)為膽管腺癌。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法 制作組織芯片（tissue microarrays，TMA)：由用福爾馬林固定、石蠟包埋的約200例組織蠟塊構(gòu)成。對(duì)于每一個(gè)腫瘤，根據(jù)蘇木精-伊紅（HE）染色具有代表性的腫瘤區(qū)域進(jìn)行了仔細(xì)的選擇，并構(gòu)建蠟塊[8]。染色后的病理切片置于200倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，DSG2陽性表達(dá)位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上，觀察細(xì)胞的陽性表達(dá)情況。

1.2.3 染色結(jié)果判定DSG2陽性表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上，染色呈黃色或棕黃色顆粒狀分布。根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：0分，無染色；1分，淡黃色；2分，黃色；3分，褐色。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分：0分為＜10%，1分為10%～59%，2分為60%～89%，3分為90%～100%?？偡譃槿旧珡?qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分相乘，總分≤2分為DSG2低表達(dá)，＞2分為DSG2高表達(dá)。

1.3 隨訪

對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，腫瘤門診或電話進(jìn)行隨訪。隨訪72個(gè)月?？偵鏁r(shí)間定義為初次治療結(jié)束至因疾病死亡時(shí)間或隨訪截止日期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。DSG2在膽管癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)差異采用t-Test配對(duì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Cox回歸模型對(duì)膽管癌患者總生存期的影響因素進(jìn)行分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽管癌組織和癌旁正常組織中DSG 2的表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示：膽管癌組織中可見腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)被染成黃色或棕黃色顆粒，而癌旁正常組織中偶見陽性染色（圖1）。膽管癌組織中DSG2的高表達(dá)率為73.8%（104/141），高于癌旁正常組織的20.0%（8/40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（chi-square=4.713，P=0.03）。帶有確切臨床數(shù)據(jù)的141例膽管癌患者中，104例患者的DSG2呈高表達(dá)，37例患者呈低表達(dá)。收集到的配對(duì)40例癌組織和癌旁正常組織中，癌組織高表達(dá)者17例，低表達(dá)者23例，癌旁組織高表達(dá)者8例，低表達(dá)者32例。

圖1 膽管癌組織和癌旁正常組織中DSG 2的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×200）

2.2 DSG 2表達(dá)情況與膽管癌患者臨床特征的關(guān)系

不同性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、T分期膽管癌患者膽管癌組織中DSG2的高表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；N0、M0、I～Ⅱ期膽管癌患者膽管癌組織中DSG2的高表達(dá)率均高于N1、M1、Ⅲ～Ⅳ期膽管癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征膽管癌患者膽管癌組織中DSG 2的表達(dá)情況

2.3 膽管癌患者總生存情況的影響因素分析

單因素分析結(jié)果顯示：不同性別、組織學(xué)分級(jí)、年齡、M分期膽管癌患者的總生存期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同DSG2表達(dá)情況、T分期、N分期、TNM分期膽管癌患者的總生存期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。多因素分析結(jié)果顯示：DSG2低表達(dá)為影響膽管癌患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表2）

表2 膽管癌患者總生存期的影響因素分析（ n=141）

2.4 DSG 2表達(dá)與膽管癌患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系

DSG2高表達(dá)膽管癌患者的術(shù)后中位生存時(shí)間是21.8個(gè)月，DSG2低表達(dá)膽管癌患者的術(shù)后中位生存時(shí)間是10.0個(gè)月。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，DSG2高表達(dá)膽管癌患者的生存情況明顯優(yōu)于DSG2低表達(dá)膽管癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.354，P=0.004）。（圖2）

圖2 DSG2高表達(dá)（ n=104）與低表達(dá)（ n=37）膽管癌患者的生存曲線

3 討論

膽管癌起病較為隱匿，早期膽管癌患者無明顯的臨床癥狀，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)病情[9-10]。大多數(shù)患者確診時(shí)已屬于進(jìn)展期，失去最佳的治療時(shí)機(jī)；且由于膽管本身具有復(fù)雜、特殊的解剖結(jié)構(gòu)，均不利于患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，關(guān)于分子基因水平的研究成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。DSG家族包含4個(gè)亞型，即DSG1、DSG2、DSG3和DSG4。在一些腫瘤細(xì)胞中，僅DSG2會(huì)呈現(xiàn)高水平的表達(dá)[11-12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，DSG2在某些腫瘤組織表達(dá)異常，如胃癌、皮膚癌、乳腺癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤[12]。本研究主要利用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究DSG2在膽管癌組織中的表達(dá)情況，探討DSG2在膽管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

本研究首先觀察了DSG2在膽管癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，膽管癌組織中可見腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)被染成黃色或棕黃色顆粒，而癌旁正常組織細(xì)胞的細(xì)胞膜上偶見黃色顆粒。在收集到的配對(duì)的40例膽管癌組織和癌旁正常組織中，膽管癌組織中DSG2高表達(dá)者17例，DSG2低表達(dá)者23例；癌旁正常組織中DSG2高表達(dá)者8例，DSG2低表達(dá)者32例。膽管癌組織中DSG2的高表達(dá)率高于癌旁正常組織（P＜0.05）。帶有確切臨床數(shù)據(jù)的141例膽管癌中，104例患者的DSG2呈高表達(dá)，37例患者呈低表達(dá)。表明不同表達(dá)水平的DSG2，在膽管癌和癌旁正常組織中呈現(xiàn)明顯的異常表達(dá)，提示DSG2在膽管癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能起作用。

本研究其次分析了帶有確切臨床數(shù)據(jù)的141例膽管癌中DSG2的表達(dá)與臨床特征的相應(yīng)關(guān)系。不同性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、T分期膽管癌患者膽管癌組織中DSG2的高表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；N0、M0、I～Ⅱ期膽管癌患者DSG2的高表達(dá)率均高于N1、M1、Ⅲ～Ⅳ期膽管癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著膽管癌的不斷進(jìn)展，DSG2的表達(dá)逐漸下調(diào)，進(jìn)而提示DSG2表達(dá)下調(diào)可能在膽管癌發(fā)展中扮演著重要的角色。而且，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，DSG2高表達(dá)膽管癌患者的生存情況優(yōu)于DSG2低表達(dá)膽管癌患者，表明DSG2有可能成為評(píng)價(jià)膽管癌預(yù)后的標(biāo)志。這與Barber等[7]關(guān)于丟失DSG2是侵襲性前列腺癌預(yù)后不良標(biāo)志的論斷相一致。并且用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn)，DSG2低表達(dá)被證明為膽管癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后影響因子。

本研究與Zhang等[13]關(guān)于建議DSG2可能是腫瘤抑制候選基因的報(bào)道相吻合，但與Cai等[14]研究結(jié)果相違背，但抑癌基因并不是一定在膽管癌組織中低表達(dá)、正常組織中高表達(dá)，本研究比較了40對(duì)膽管癌組織和癌旁組織樣本的組化數(shù)據(jù)顯示了這一點(diǎn)。DSG2在膽管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)存在差異，似乎抑癌基因應(yīng)該在膽管癌組織中低表達(dá)，但它也可能是在腫瘤中高表達(dá)，從而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，本研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，后續(xù)為了探究DSG2如何發(fā)揮抑癌作用會(huì)在細(xì)胞水平上繼續(xù)進(jìn)行研究，并且擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

目前，橋粒及組成成分DSG2在膽道癌中的生物學(xué)作用及其機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果可以推測(cè)DSG2的表達(dá)下調(diào)可能會(huì)破壞細(xì)胞橋粒間連接的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致相應(yīng)細(xì)胞功能發(fā)生異常，從而降低了膽管癌細(xì)胞的粘附性，使得膽管癌細(xì)胞容易發(fā)生變形脫落，進(jìn)而增強(qiáng)了其侵襲周邊組織的能力。Kume等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤進(jìn)展過程中，DSG2會(huì)改變上皮細(xì)胞成分，進(jìn)而與上皮細(xì)胞鈣黏附蛋白發(fā)生作用，降低腫瘤細(xì)胞的黏附性，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同TNM分期膽管癌患者的DSG2表達(dá)存在差異，進(jìn)一步證實(shí)了DSG2在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的臨床意義?？偟膩碚f，DSG2在各種人類腫瘤中是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展還是抑制腫瘤尚不清楚，這表明有必要進(jìn)一步深入研究其在腫瘤中的作用。

綜上所述，本研究提示DSG2在膽管癌組織中的表達(dá)水平的改變參與膽管癌的發(fā)生、發(fā)展，并通過單因素和多因素分析推測(cè)其可能與膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，進(jìn)而推測(cè)其可作為膽管癌診治以及判定預(yù)后的一種新型腫瘤標(biāo)志物。