不同水溫下無乳鏈球菌在尼羅羅非魚體內(nèi)的動態(tài)分布及其消除規(guī)律*

郭富強(qiáng) 張德鋒 曹建萌 劉志剛 可小麗 盧邁新

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不同水溫下無乳鏈球菌在尼羅羅非魚體內(nèi)的動態(tài)分布及其消除規(guī)律*

郭富強(qiáng)1,2張德鋒1,3曹建萌1劉志剛1可小麗1,3盧邁新1,3①

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室 廣州 510380；2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心 上海 201306； 3. 廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室 廣州 510380)

本研究以腹腔注射無乳鏈球菌(, WC1535菌株)后的尼羅羅非魚(，GIFT strain)為研究對象，研究不同水溫下無乳鏈球菌在尼羅羅非魚體內(nèi)的動態(tài)分布及消除規(guī)律。首先，分析25℃、29℃和33℃3個實驗組羅非魚的感染累積死亡率；其次，對3個實驗組羅非魚進(jìn)行無乳鏈球菌的體外分離、培養(yǎng)和計數(shù)；然后，分析感染后不同實驗組羅非魚腦、肝臟、脾臟和腎臟組織中無乳鏈球菌的濃度。結(jié)果顯示，隨著水溫的升高羅非魚的累積死亡率也隨之升高，25℃、29℃和33℃組的累積死亡率分別為6.67%、25.56%和78.90%。菌落統(tǒng)計結(jié)果顯示，隨著水溫的升高，無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的增殖速度加快，同時，單位質(zhì)量組織(腦、肝臟、脾臟和腎臟)中無乳鏈球菌的最大載菌量也隨之升高。本研究還發(fā)現(xiàn)，無乳鏈球菌在羅非魚脾臟中的濃度最高，在腎臟中的存活時間最長。綜上可知，尼羅羅非魚感染無乳鏈球菌后，體內(nèi)各組織中鏈球菌的增殖、消除速度均與水溫密切相關(guān)。本研究為研究無乳鏈球菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為通過合理調(diào)控水溫及施藥等措施防治尼羅羅非魚鏈球菌病的暴發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

溫度；尼羅羅非魚；無乳鏈球菌；動態(tài)分布；消除規(guī)律

羅非魚(sp.)因其食性廣、生長快、抗病力強(qiáng)以及環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)而著稱，被譽(yù)為未來動物性蛋白質(zhì)的主要來源之一，已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織向全世界推廣。但是，隨著我國羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度的提高以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，近年來，各種病害的暴發(fā)也越來越頻繁，其中，鏈球菌病是我國羅非魚主要的細(xì)菌性疾病，該病的連年暴發(fā)給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(朱潔蓮等, 2017)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚鏈球菌病的主要病原是無乳鏈球菌()(方偉等, 2016; 張德鋒等, 2017)，該病的流行時間為每年的5~10月，其中，7~ 9月為流行高峰期。當(dāng)水溫在28℃以上時易發(fā)病，當(dāng)水溫高于32℃時極易暴發(fā)，死亡率可高達(dá)80%~ 95%(盧邁新等, 2010; 張新艷等, 2008)。如，2009年的高溫季節(jié)，廣東、海南、福建和廣西等羅非魚主養(yǎng)區(qū)鏈球菌病的發(fā)病率為20%~50%，死亡率高達(dá)50%~70%(盧邁新, 2010)，這表明羅非魚鏈球菌病的暴發(fā)與水溫密切相關(guān)。

目前，國內(nèi)外關(guān)于羅非魚鏈球菌病的研究主要集中在病情描述、病原菌的分離鑒定(黃艷華等, 2014; 譚晶晶等, 2010; 張德鋒等, 2015)、疫苗研發(fā)(Evans, 2004; Klesius, 2000; Sun, 2010; 王蓓等, 2014; 吳斌等, 2016)和藥物防治(鄧恒為等, 2014; 王德強(qiáng)等, 2017)等研究領(lǐng)域，而無乳鏈球菌在不同水溫下羅非魚體內(nèi)主要器官組織中增殖和消除規(guī)律的研究鮮見報道。由于水溫是羅非魚鏈球菌病發(fā)病或暴發(fā)極為重要的誘因之一，因此，了解無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的組織動態(tài)分布以及增殖、消除規(guī)律對有效防治羅非魚鏈球菌病是十分重要的。

本研究以人工感染無乳鏈球菌的尼羅羅非魚(, GIFT strain)為研究對象，采用平板計數(shù)法分析不同水溫條件下羅非魚感染無乳鏈球菌后的腦、肝臟、脾臟和腎臟等主要器官組織中病原菌的動態(tài)分布以及增殖、消除規(guī)律，以期為羅非魚鏈球菌病的預(yù)防、診斷和藥物防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗魚 實驗魚為尼羅羅非魚，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所高要水產(chǎn)種質(zhì)中心提供。本研究選取健康羅非魚1980尾，體重為40~60 g/尾，實驗前進(jìn)行抽樣檢測，結(jié)果顯示，該批次羅非魚未攜帶無乳鏈球菌。

1.1.2 菌株 無乳鏈球菌WC1535菌株由本實驗室分離、鑒定并保存，該菌株對羅非魚具有強(qiáng)致病性。根據(jù)預(yù)實驗獲得30℃時無乳鏈球菌對羅非魚的半數(shù)致死劑量(LD50)為5.0×107CFU/ml。實驗前，在血瓊脂平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)，并挑取單克隆接種于腦心浸出液肉湯(BHI)液體培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體，用無菌PBS緩沖液將菌液稀釋至5.0×107CFU/ml備用。

1.2 方法

1.2.1 人工感染實驗 選取540尾健康羅非魚，分為25℃、29℃和33℃3個實驗組，25℃、29℃和33℃3個對照組，每組90尾，在循環(huán)水玻璃缸中暫養(yǎng)1周后用于實驗。實驗養(yǎng)殖條件：實驗組和對照組的水溫分別調(diào)至25℃、29℃和33℃，實驗期間，各組水溫變動幅度為±0.5℃；為保證良好的水質(zhì)條件及溶氧，整個實驗過程采用循環(huán)水養(yǎng)殖，并不間斷充氣；每天投喂飼料2次，每日投喂量約為魚體重的3.0%。實驗組羅非魚每尾腹腔注射0.1 ml濃度為5.0× 107CFU/ml的無乳鏈球菌，對照組羅非魚腹腔注射等體積的無菌PBS緩沖液。感染后，每天觀察實驗魚的發(fā)病情況，并及時清除死魚，記錄各組的死魚數(shù)量，持續(xù)觀察7 d后，統(tǒng)計各組實驗魚的死亡數(shù)。

1.2.2 無乳鏈球菌的分離培養(yǎng) 選取1440尾健康羅非魚，分25℃、29℃和33℃3個實驗組，25℃、29℃和33℃3個對照組，每組設(shè)置3個重復(fù)，25℃和29℃各組每個重復(fù)60尾魚，33℃實驗組和對照組每個重復(fù)120尾魚(為保證能夠連續(xù)取樣)，分別于循環(huán)水玻璃缸中暫養(yǎng)1周后用于實驗。

實驗組羅非魚每尾腹腔注射0.1 ml濃度為5.0×107CFU/ml的無乳鏈球菌，對照組注射等體積的無菌PBS緩沖液。分別在感染后3 h、6 h、12 h、24 h、2 d、4 d、6 d、10 d、15 d、20 d和30 d，從各實驗組的每個重復(fù)中隨機(jī)選取3尾體表癥狀相似且尚未死亡的羅非魚，無菌條件下取腦、肝臟、脾臟和腎臟等組織，稱重后以0.20 g/ml的比例加入PBS緩沖液，用高通量組織研磨儀(北京鼎昊源科技有限公司，型號TL-2010S)充分研磨，然后1500 r/min低速離心30 s沉淀組織碎片，取上清液，進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，吸取10 μl涂布于BHI瓊脂平板上，每個樣品6個重復(fù)，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，觀察菌落形態(tài)，統(tǒng)計菌落數(shù)量，并根據(jù)相應(yīng)菌落數(shù)計算各組織中單位質(zhì)量的菌體濃度。同樣地，無菌條件下分別取對照組的腦、肝臟、脾臟和腎臟等組織，稱重、研磨、短暫離心，稀釋后涂布于BHI平板上進(jìn)行無乳鏈球菌培養(yǎng)和菌落計數(shù)。

1.2.3 菌落的形態(tài)判定和分子鑒定 每個時間點取樣統(tǒng)計菌落數(shù)時，隨機(jī)挑取10個形態(tài)相近的單克隆菌落用無乳鏈球菌特異基因的引物(cfb-F: 5￠-TAGCTTAGTTATCCCAAATCCC-3￠, cfb-R: 5￠- TAAAGACTTCATTGCGTGCC-3￠)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析(劉志剛等, 2013)。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析法(One-way ANOVA)、卡方檢驗分析法(Chi-square test)，分別對不同溫度下羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌濃度和感染無乳鏈球菌后羅非魚累積死亡率進(jìn)行差異顯著性分析，<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。采用GraphPad Prism 6的Survival和Column-Mean±SD對累積死亡率及病原菌濃度進(jìn)行作圖和分析。

2 結(jié)果

2.1 人工感染實驗結(jié)果

不同實驗組羅非魚感染無乳鏈球菌后，25℃、29℃和33℃組的累積死亡率分別為6.67%、25.56%和78.90%，對照組均未出現(xiàn)死亡。從生存曲線可以看出(圖1)，25℃組的羅非魚在感染后48 h內(nèi)未出現(xiàn)死亡，48 h后開始出現(xiàn)少量死亡；29℃實驗組在感染24 h后開始死亡，24~48 h的死亡量緩慢增加，之后死亡量逐漸減少；33℃高溫組的羅非魚感染9 h后即出現(xiàn)死亡，在12~24 h內(nèi)的死亡量急劇升高，為發(fā)病高峰期，48 h后的死亡量逐漸趨于穩(wěn)定。

圖1 尼羅羅非魚感染無乳鏈球后的生存曲線

**為差異極顯著(<0.01)

** denoted highly significant differences(<0.01)

實驗組羅非魚感染無乳鏈球菌后，不同發(fā)病時期的癥狀存在差異。發(fā)病初期(<9 h)，各實驗組羅非魚體表無明顯癥狀，25℃實驗組的羅非魚內(nèi)臟器官無明顯病變，29℃和33℃實驗組羅非魚的肝臟、脾臟輕微腫大。感染后12~24 h，25℃實驗組無癥狀，29℃實驗組部分出現(xiàn)側(cè)翻、打轉(zhuǎn)癥狀，33℃實驗組表現(xiàn)出明顯的側(cè)翻、打轉(zhuǎn)和離群獨游等現(xiàn)象，并出現(xiàn)大量死亡。進(jìn)入發(fā)病期后(12~72 h)，25℃實驗組發(fā)病羅非魚的癥狀仍不明顯，29℃實驗組和33℃實驗組部分病魚眼球突出或渾濁、眼眶充血、肛門紅腫、腹部膨大、體表發(fā)黑，并出現(xiàn)側(cè)翻、打轉(zhuǎn)和離群獨游等現(xiàn)象，解剖可見腦膜炎，肝臟充血腫大發(fā)黑、腎臟腫大、脾臟充血發(fā)暗，為典型的無乳鏈球菌感染癥狀。

2.2 病原菌的分離培養(yǎng)和菌落數(shù)統(tǒng)計

分析各實驗組羅非魚的腦、肝臟、脾臟和腎臟組織中的病原菌濃度(表1~表3)可知，感染后3 h，實驗組羅非魚腦、肝臟、脾臟和腎臟組織內(nèi)均可分離到無乳鏈球菌，但是各組織中的病原菌濃度均處于較低水平(5.29×103~1.96×106CFU/g)。感染后6 h，3個實驗組羅非魚各組織中病原菌的濃度逐漸增加，其中，33℃實驗組羅非魚各組織中的無乳鏈球菌增殖速度極快(最高可達(dá)3.84×109CFU/g·h)。所有對照組羅非魚體內(nèi)未分離到無乳鏈球菌。

表1 25℃水溫條件下尼羅羅非魚4種組織中無乳鏈球菌平均濃度與感染時間的關(guān)系

Tab.1 Relationship between infection time and average abundance of S. agalactiae in the four tissues of O. niloticus at 25℃water temperature(CFU/g)

感染后12 h，33℃實驗組各組織中無乳鏈球菌濃度即可達(dá)到峰值，其腦、肝臟、脾臟和腎臟組織中無乳鏈球菌含量分別為(9.18×108±1.44×108)、(4.60× 109±2.19×108)、(3.46×1010±2.06×109)、(8.08×109±2.19× 109) CFU/g (表3)。感染后24 h，25℃實驗組羅非魚體內(nèi)腦、肝臟、脾臟和腎臟組織中的無乳鏈球菌濃度均達(dá)到峰值，其含量分別為(2.73×105±5.20×104)、(1.55×107±3.64×106)、(8.18×107±1.26×107)、(6.26×107± 7.52×106) CFU/g (表1)。29℃實驗組羅非魚肝臟、脾臟和腎臟中無乳鏈球菌濃度同樣在感染后24 h達(dá)到峰值，其含量分別為(1.76×109±1.97×108)、(3.56×109± 4.93×108)和(2.70×109±3.65×108) CFU/g，但是，腦組織中無乳鏈球菌濃度峰值出現(xiàn)在感染后48 h，其含量為(7.87× 108±8.87×107) CFU/g (表2)。

表2 29℃水溫條件下尼羅羅非魚4種組織中無乳鏈球菌平均濃度與感染時間的關(guān)系

Tab.2 Relationship between infection time and average abundance of S. agalactiae in the four tissues of O. niloticus at 29℃water temperature(CFU/g)

表3 33℃水溫條件下尼羅羅非魚4種組織中無乳鏈球菌平均濃度與感染時間的關(guān)系

Tab.3 Relationship between infection time and average abundance of S. agalactiae in the four tissues of O. niloticus at 33℃water temperature(CFU/g)

分析無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的平均增殖速度可知，33℃組羅非魚4個組織中無乳鏈球菌的平均增殖速度均比29℃組和25℃組的要快。本研究中，羅非魚脾臟中無乳鏈球菌的平均增殖速度最大，33℃組、29℃組和25℃組脾臟組織中無乳鏈球菌的平均增殖速度分別為3.84×109、1.69×108和3.56×106CFU/g·h。腦組織中的平均增殖速度最小，分別為1.02×108、1.75×107和1.27×104CFU/g·h (表4)。

表4 不同實驗組羅非魚體內(nèi)不同組織中無乳鏈球菌的平均增殖速度

Tab.4 Average propagation speed of S. agalactiae in various infected tissues of O. niloticus in different experimental groups [CFU/(g·h)]

各實驗組羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌濃度達(dá)到峰值后，隨著感染時間的延長，體內(nèi)無乳鏈球菌濃度逐漸下降(表1~表3)。感染2 d后，33℃實驗組的4個組織(腦、肝臟、脾臟和腎臟)中無乳鏈球菌濃度即明顯下降(降低2~4個數(shù)量級)，而25℃和29℃實驗組在感染4 d后，4個組織(腦、肝臟、脾臟和腎臟)中無乳鏈球菌濃度才呈現(xiàn)明顯下降趨勢；感染6 d后，各實驗組存活羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌濃度均降至較低水平(1.38×102~2.44×104CFU/g)，感染10 d后，33℃實驗組存活羅非魚體內(nèi)已分離不到無乳鏈球菌；29℃實驗組感染15 d后，只能從存活羅非魚腎臟中分離到少量無乳鏈球菌，但是感染20 d后，則分離不到無乳鏈球菌；感染25 d后，25℃實驗組存活羅非魚腎臟中能夠分離到少量的無乳鏈球菌，但感染30 d后，存活的羅非魚體內(nèi)分離不到無乳鏈球菌。

2.3 病原菌濃度、累積生存率與感染時間的關(guān)系

分析尼羅羅非魚感染無乳鏈球菌后，腦、肝臟、脾臟和腎臟組織中病原菌濃度、累積生存率與感染時間之間的關(guān)系(圖1~圖5)可知，水溫越高，羅非魚感染的累積死亡率越高，各組織中病原菌的增殖速度越快，組織中病原菌的濃度也越高。實驗表明，高溫組(33℃)羅非魚的脾臟和腎臟中無乳鏈球菌的濃度峰值極顯著高于25℃和29℃實驗組(<0.01)。研究發(fā)現(xiàn)，同一溫度組羅非魚感染無乳鏈球菌后，不同組織中無乳鏈球菌的增殖速度卻不相同，肝臟、脾臟和腎臟中病原菌增殖速度較快，腦組織中無乳鏈球菌的增殖速度相對較慢(表4)。相同溫度組的羅非魚體內(nèi)各組織中的無乳鏈球菌最大濃度也不相同，感染初期(0~2 d)腦組織中無乳鏈球菌的濃度通常低于同時期肝臟、脾臟和腎臟等組織中無乳鏈球菌的濃度。

圖2 尼羅羅非魚腦組織中無乳鏈球菌濃度隨感染時間的變化趨勢

圖3 尼羅羅非魚肝臟組織中無乳鏈球菌濃度隨感染時間的變化趨勢

圖4 尼羅羅非魚脾臟組織中無乳鏈球菌濃度隨感染時間的變化趨勢

圖5 尼羅羅非魚腎臟組織中無乳鏈球菌濃度隨感染時間的變化趨勢

2.4 菌落的形態(tài)特征和分子鑒定

對每個時間點取樣涂布過夜培養(yǎng)的平板進(jìn)行菌落觀察，其中，表面光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊、乳白色、直徑為0.5~2.0 mm的菌落即為疑似無乳鏈球菌。挑取疑似單菌落，將無乳鏈球菌特異基因作為檢測對象，每組隨機(jī)挑取10個單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到170 bp的目的條帶，與預(yù)期相符，則確定疑似菌落為無乳鏈球菌。

3 討論

羅非魚鏈球菌病作為國家三類動物性疫病，是一種高溫高發(fā)、高傳染性、高死亡率的細(xì)菌性疾病 (可小麗等, 2013)。近年來，鏈球菌病在我國南方羅非魚主養(yǎng)區(qū)呈現(xiàn)暴發(fā)性流行，其發(fā)病率和死亡率均較高，特別是在高溫季節(jié)(盧邁新, 2010)。因此，研究水溫與羅非魚鏈球菌病暴發(fā)之間的關(guān)系具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本研究為了解不同水溫條件下，無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的動態(tài)分布規(guī)律，選取33℃、29℃和25℃3個溫度組，分別代表了高溫期間鏈球菌病極易暴發(fā)的溫度、羅非魚最適生長溫度和低溫時幾乎無鏈球菌病發(fā)病的溫度，以人工注射感染的方式，通過對感染后羅非魚的腦、肝臟、脾臟和腎臟組織中無乳鏈球菌的分離、鑒定以及菌落數(shù)統(tǒng)計分析，以期模擬不同發(fā)病過程中，無乳鏈球菌在羅非魚群體體內(nèi)的動態(tài)分布及其增殖、消除規(guī)律。由于實驗過程中樣本量不夠大以及羅非魚存在個體差異的原因，本研究中羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌動態(tài)變化主要是指群體中病原菌的動態(tài)分布。

本研究表明，水溫越高羅非魚鏈球菌病的發(fā)病越快，死亡率越高。水溫由25℃升至33℃時，羅非魚感染無乳鏈球菌后的發(fā)病死亡時間從48 h縮短至9 h，而且高溫組羅非魚的累積死亡率(78.90%)極顯著高于低溫組(6.67%)(<0.01)。高溫組患病羅非魚的臨床癥狀如打轉(zhuǎn)、側(cè)翻、離群狂游、體色發(fā)黑等，與前人所報道的結(jié)果十分相似(鄺偉鍵等, 2017; 王均等, 2011; 魏順等, 2016)。然而，低溫組發(fā)病羅非魚僅出現(xiàn)體色發(fā)黑、游動緩慢的癥狀。以上結(jié)果表明，水溫顯著影響了羅非魚鏈球菌病的發(fā)病進(jìn)程和臨床癥狀。高水溫條件下，羅非魚感染無乳鏈球菌后發(fā)病迅速、死亡率高，這與每年高溫季節(jié)羅非魚鏈球菌病易暴發(fā)、發(fā)病快和死亡率高等特征十分吻合?？赡苁且驗楦邷貢r無乳鏈球菌在羅非魚的體內(nèi)繁殖快、毒力強(qiáng)，無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的增殖速度大于消除速度，導(dǎo)致了羅非魚鏈球菌病發(fā)病迅速、死亡率高、病程長、治/自愈慢等現(xiàn)象。在高溫條件下，無乳鏈球菌毒力相關(guān)基因、嘌呤代謝和鐵攝取相關(guān)基因表達(dá)與低溫相比呈上升趨勢，而且高溫時，無乳鏈球菌對宿主的侵襲力(包括黏附、定植、入侵、繁殖、擴(kuò)散及抵抗宿主防御的能力等)和產(chǎn)毒素能力均比低溫條件下的高(Freitas Lione, 2010; Mereghetti, 2008; 石潔等, 2012)，以上這些因素導(dǎo)致了無乳鏈球菌對羅非魚的致病力增強(qiáng)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，高溫能夠引起羅非魚免疫力降低，如抗氧化酶活性、巨噬細(xì)胞溶菌酶活性、補(bǔ)體活性下降和血清溶菌酶活性受到抑制等，導(dǎo)致魚體對病原菌的易感性增強(qiáng)(陳家長等, 2011)。以上綜合因素共同作用致使羅非魚在高溫時感染無乳鏈球菌的死亡率顯著升高，這也暗示水溫可顯著影響無乳鏈球菌對羅非魚的致病力。

本研究發(fā)現(xiàn)，水溫越高無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的增殖速度越快。菌落統(tǒng)計結(jié)果顯示，高溫組(33℃)羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌的濃度在感染后12 h即達(dá)到峰值；然而，29℃組和25℃組羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌達(dá)到峰值需要24 h，甚至48 h。25℃實驗組、29℃實驗組和33℃實驗組無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的最大平均增殖速度分別為3.56×106、1.69×108和3.84× 109CFU/g·h。水溫從25℃升到33℃，無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的平均增殖速度提高了1079.5倍，這表明，水溫可顯著影響無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的增殖速度，而且水溫越高，無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的增殖速度越快。

與其增殖速度相比，當(dāng)實驗組羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌濃度達(dá)到峰值后，其消除速度均較慢。數(shù)據(jù)分析表明，無乳鏈球菌的消除速度隨著溫度的升高而加快，水溫越高消除速度越快，所需消除時間越短，例如：25℃組羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌完全被清除需要30 d，而29℃組和33℃組分別需要20和10 d。而且無乳鏈球菌在腎臟中的滯留時間最長，腎臟可能是無乳鏈球菌侵染羅非魚的主要靶器官。此外，通過分析無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的增殖速度和消除速度發(fā)現(xiàn)，水溫越高無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的增殖速度和消除速度均較快，并且明顯快于低溫組。研究表明，無乳鏈球菌可以在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活(Guo, 2014)，其通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控以適應(yīng)吞噬體內(nèi)的環(huán)境，形成胞內(nèi)寄生，使得無乳鏈球菌逃避宿主的免疫監(jiān)視(Zlotkin, 2003)，這也解釋了為何無乳鏈球菌可以在羅非魚體內(nèi)長期存活。然而，水溫可以明顯影響無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的存活時間，即逃逸時間，本研究將為進(jìn)一步揭示其免疫逃逸機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚感染無乳鏈球菌后，水溫越高，單位質(zhì)量組織(腦、肝臟、脾臟和腎臟)中無乳鏈球菌的濃度越高。分析不同實驗組羅非魚各組織中的最大載菌量可以發(fā)現(xiàn)，33℃組脾臟中的最大載菌量分別是29℃和25℃組的9.7倍和422.8倍；33℃組腎臟中的最大載菌量分別是29℃和25℃組的3.0倍和129.1倍；33℃組腦中的最大載菌量分別是29℃和25℃組的1.2倍和3361.1倍；33℃組肝臟中的最大載菌量分別是29℃和25℃組的2.6倍和296.5倍，表明水溫可以顯著影響無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的濃度。高溫組羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌的濃度高，其死亡率也高；低溫組羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌的濃度低，其死亡率也低。表明高溫條件下羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌濃度的增加也是導(dǎo)致羅非魚死亡率升高的重要原因之一，這也表明羅非魚體內(nèi)無乳鏈球菌的濃度與其死亡率存在密切的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，與高溫組相比，低溫組(25℃)羅非魚腦、肝臟、脾臟和腎臟組織中無乳鏈球菌的最大載菌量均較低，表明低溫條件下無乳鏈球菌對羅非魚的以上4種組織的侵染能力降低，尤其是腦組織，這解釋了低溫組發(fā)病羅非魚的鏈球菌病癥狀(如側(cè)翻、打轉(zhuǎn)游動)不明顯的原因。此外，本研究中，發(fā)病時期羅非魚脾臟的無乳鏈球菌濃度通常比其他3個組織中的高，暗示脾臟也可能是無乳鏈球菌侵襲羅非魚的重要靶器官。

綜上可知，尼羅羅非魚感染無乳鏈球菌后，養(yǎng)殖水溫越高，其感染死亡率越高，單位質(zhì)量的腦、肝臟、脾臟和腎臟組織中無乳鏈球菌的最大載菌量也越高。本研究發(fā)現(xiàn)，水溫能夠影響無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的增殖速度和存活時間，可顯著影響無乳鏈球菌在羅非魚體內(nèi)的濃度，進(jìn)而影響無乳鏈球菌對羅非魚的致病性，這表明，溫度是羅非魚鏈球菌病暴發(fā)的關(guān)鍵因子之一。本研究較好地解釋了高溫季節(jié)羅非魚鏈球菌病易暴發(fā)、死亡率高這一現(xiàn)象。本研究表明，在羅非魚養(yǎng)殖過程中，應(yīng)注意鏈球菌病暴發(fā)時期的水溫，建議根據(jù)不同的養(yǎng)殖水溫采取不同的防控措施和施藥策略。本研究也將為羅非魚鏈球菌病的弱毒活疫苗研發(fā)提供參考依據(jù)，即免疫時期水溫的高低將影響弱毒株在羅非魚體內(nèi)的存活時間，進(jìn)而影響疫苗株對機(jī)體免疫刺激的時間。

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Dynamic Distribution and Elimination Patterns ofinat Different Water Temperatures

GUO Fuqiang1,2, ZHANG Defeng1,3, CAO Jianmeng1, LIU Zhigang1, KE Xiaoli1,3, LU Maixin1,3①

(1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380; 2. National Demonstration Center for Experimental National Demonstration Center for Experimental, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology, Guangdong Province, Guangzhou 510380)

Based on the dynamic distribution and elimination patterns ofinat different water temperatures, we provide a foundation for research onpathogenesis inas well as a scientific basis for the prevention and control ofinfection inby controlling water temperature and the rational use of drugs. We usedinfected with(WC1535 strain) by artificial intraperitoneal injection. First, the mortality rates of infectedwere assessed at 25℃, 29℃, and 33℃. Then, we performedisolation, cultured and countedfrom the infected fish maintained at three temperatures. Next, we assessed the abundance ofin the brain, liver, spleen, and kidney tissues of the infected fish at the three temperatures. The results showed that fish mortality rate increased with increasing water temperature, and the cumulative mortality rate was 6.67%, 25.56%, and 78.90% at 25℃, 29℃ and 33℃, respectively. Furthermore, the maximum abundance ofin unit mass of the brain, liver, spleen, and kidney tissues ofincreased with increasing water temperature. Thus, at a high temperature,propagated rapidly in, whereas the residence time was short. In contrast, at a lower temperature, the propagation time decreased, but the residence time increased. Moreover, our results showed thatabundance was the highest in the spleen and survival time was the longest in the kidney. In conclusion, the propagation and elimination speeds ofin tissues of infectedwere closely related to water temperature. Our results provide important data for further study ofpathogenesis, ensuring effective prevention and control measures.

Temperature;;; Dynamic distribution; Elimination patterns

LU Maixin, E-mail: mx-lu@163.com

郭富強(qiáng), 張德鋒, 曹建萌, 劉志剛, 可小麗, 盧邁新. 不同水溫下無乳鏈球菌在尼羅羅非魚體內(nèi)的動態(tài)分布及其消除規(guī)律. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(6): 81–88

Guo FQ, Zhang DF, Cao JM, Liu ZG, Ke XL, Lu MX.Dynamic distribution and elimination patterns ofinat different water temperatures. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 81–88

* 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-46)、廣東省自然科學(xué)基金項目(2014A030310097)和廣東省海洋和漁業(yè)發(fā)展專項資金(魚病防治)(20170070000600403)共同資助[This work was supported by the China Agriculture Research System(CARS-46), the Natural Science Foundation of Guangdong Province(2014A030310097), and the Special Project for Marine and Fishery Development (Fish Disease Control) in Guangdong Province(20170070000600403)]. 郭富強(qiáng)，E-mail: gfq07083737@163.com

盧邁新，研究員，E-mail: mx-lu@163.com

2017-11-01,

2017-11-16

10.19663/j.issn2095-9869.20171101001

S945

A

2095-9869(2018)06-0081-08

(編輯 馬璀艷)