艾拉莫德對干燥綜合征模型小鼠的影響

吳曉暢 王領 張娜 趙福濤

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院風濕免疫科（上海 201999）

干燥綜合征是一種主要侵犯外分泌腺的自身免疫性疾病，能導致口干、眼干及內臟系統(tǒng)損害等臨床表現(xiàn)［1］。該病發(fā)病率高，嚴重影響患者生命質量。其病理特征為外分泌腺大量淋巴細胞浸潤及實質組織細胞破壞；血清中多種炎性因子水平升高，并參與到疾病發(fā)展過程［2］。因此，抑制炎性細胞浸潤外分泌，抑制炎性因子產(chǎn)生及作用通路是治療該病的關鍵，但目前針對該病治療上主要以對癥治療為主，目前有效治療的藥物有限。艾拉莫德作為一種具有新的抗炎和免疫調節(jié)性質小分子藥物，已用于類風濕性關節(jié)炎的治療，根據(jù)作用機制臨床上也在試用于治療其它多種風濕病，包括干燥綜合征［3］，且收到了確切療效，但缺乏基礎研究的支持。本研究擬在通過小鼠體內實驗探究艾拉莫德對于干燥綜合征模型（NOD）小鼠的作用，從而探討艾拉莫德的有效性及可能機制，為其治療SS提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物8周齡NOD雌性小鼠，18只，SPF級，平均體重為18～20 g；7周齡C57BL/6雌性小鼠，6只，SPF級；采購于中國上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物合格證號：2015000533754/2015000526399。生產(chǎn)許可證號碼為：SCXK（滬）2012?0002。

1.1.2試劑（1）羧甲基纖維素鈉為美國Sigma公司；艾拉莫德原藥（商品名：艾得辛）先聲藥業(yè)提供，批號：A17?160903；3%戊巴比妥鈉由實驗中心配制；0.1M枸櫞酸緩沖液、4%多聚甲醛、PBS緩沖液均購自中國上海實驗試劑有限公司；（2）IL?17 ELISA試劑盒、IFN?γ ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；（3）伊紅染液、蘇木素染液均購自中國北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組選取8周齡雌性NOD小鼠18只，隨機分成3組（6只/組）：模型組、艾拉莫德干預1組、艾拉莫德干預2組；雌性C57BL/6小鼠6只，作為正常對照組；均喂養(yǎng)于無特殊病菌的恒溫條件下，飲水瓶給水。至第10周齡時（實驗第0天），艾拉莫德1組每只予10 mg/kg艾拉莫德灌胃治療；艾拉莫德2組予30 mg/kg艾拉莫德灌胃治療；模型組和正常對照組每只小鼠等體積0.5%羧甲基纖維素灌胃，每天固定時間點灌胃1次。給藥量按動物與人等效劑量換算表計算得出。

1.2.2進食量、飲水量、體重變化量測量每2天固定時間點測量一次小鼠進食量（投喂重量-剩余重量，單位：g/組）、飲水量（給水重量-剩余重量，單位：g/組）、體重（單位：g/組），直至鼠齡16周停止。

1.2.3血清IL?17、IFN?γ測定16周齡時處死小鼠，并眼球取血，常規(guī)分離血清，凍存于-80℃冰箱中，同批以ELISA測定血清中IL?17、IFN?γ水平，按照試劑盒說明書操作。450 nm讀取吸光度值，繪制標準曲線，讀取各組血清標本因子含量。

1.2.4頜下腺組織學觀察將小鼠處死后，取小鼠頜下腺組織，置于10%多聚甲醛中固定，組織脫水、透明化、浸蠟和包埋，以4 μm厚度切片；將制作好的組織切片用蘇木素一伊紅（HE）染色，切片常規(guī)脫蠟，水化，染色，脫水、透明、封片。在光學顯微鏡下觀察小鼠頜下腺組織病理形態(tài)學等的變化。根據(jù)Chisholm?Mason等提出的腺體活檢分級標準進行評價：（2級以上為發(fā)?。?。0級：未見淋巴細胞浸潤；1級：少量淋巴細胞浸潤；2級：淋巴細胞中度浸潤；3級：偶有0～1個淋巴細胞浸潤灶/5個低倍鏡視野，伴有中度實質損傷；（淋巴細胞浸潤灶：指4 mm2組織內至少有50個淋巴細胞聚集于腺體間質者為一個灶）；4級：易見2～3個淋巴細胞浸潤灶/5個低倍鏡視野，伴有重度實質損傷。

1.3統(tǒng)計學方法采用Graphpad prism 5和SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)按統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多樣本間比較采用單因素方差分析以及兩組間Dunnett′s T3檢驗對比分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1艾拉莫德干預前后各組飲水量、進食量、體質量變化情況飲水量：如圖1-A，飲水量在正常對照組基本保持不變，在模型組保持較高水平維持，而從實驗第1天起，艾拉莫德1組和艾拉莫德2組給予干預后，飲水量都有明顯減少，與模型組相比均有顯著降低（P＜0.05）。進食量：如圖1-B，進食量在正常對照組基本保持不變，且進食量正常；模型組隨著鼠齡增大小鼠疾病進展，進食量逐漸降低；因艾拉莫德1組和艾拉莫德2組給予艾拉莫德干預，進食量出現(xiàn)輕度降低后又逐漸出現(xiàn)升高趨勢，與模型組相比有顯著升高（P＜0.05）。體質量：如圖1-C，體質量在正常對照組隨著鼠齡增大保持輕度增高趨勢，但基本保持平穩(wěn)，在模型組隨著鼠齡增大小鼠疾病進展，體質量逐漸降低；因艾拉莫德1組和艾拉莫德2組給予干預后，體質量都有恢復并輕度增高，與模型組相比均有顯著升高（P＜0.05）（圖1）。

2.2血清IL?17、IFN?γ濃度變化情況艾拉莫德干預干燥綜合征模型小鼠后，ELIAS測各組血清炎性因子IL?17、IFN?γ水平，其中，IL?17水平在艾拉莫德2組較模型組有減低，差異有顯著性意義（P＜0.01）；艾拉莫德2組與艾拉莫德1組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；由可得出艾拉莫德劑量增加，炎性因子IL?17降低更明顯。而IFN?γ水平在各組中的水平，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2）。

圖1 艾拉莫德干預對各組飲水量、進食量、體質量的影響Fig.1 Effect of Iguratimod on water intake（A）、food intake（B）and body weight（C）

2.3 頜下腺組織病理分級情況空白組16周齡C57BL/6小鼠均在Chisholm組織學評分標準的0級；模型組16周齡NOD小鼠均在組織學評分標準的3～4級；艾拉莫德1組NOD小鼠在組織學評分標準的2～4級；艾拉莫德2組NOD小鼠主要在組織學評分標準的1級。與正常對照組比較，模型組頜下腺組織淋巴細胞浸潤明顯，呈現(xiàn)灶性分布，外分泌腺結構破壞，腺管擴張，腺泡萎縮，而艾拉莫德1組（10 mg/kg）與艾拉莫德2組（30 mg/kg）小鼠頜下腺淋巴細胞浸潤程度較模型組有明顯減少，頜下腺組織結構破壞減輕。對頜下腺組織病理分級情況進行評價，艾拉莫德2組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3～5）。

圖2 艾拉莫德干預對NOD小鼠血清IL?17、IFN?γ濃度的影響（pg/mL± s）Fig.2 Effect of Iguratimod on serum IL?17、IFN?γ concentration in NOD mice

3 討論

干燥綜合征有著復雜的體液和細胞免疫異常，病理顯示為外分泌腺的大量炎性細胞浸潤，形成浸潤灶，對腺體的結構及功能產(chǎn)生破壞。特別是T淋巴細胞，以及由T淋巴細胞產(chǎn)生的多種炎性因子，導致外分泌腺分泌功能的缺失，出現(xiàn)口干、眼干以及內臟器官受損表現(xiàn)，嚴重影響患者的生活質量［1］。近年來，對浸潤性T細胞進行了廣泛的研究，特別是以浸潤性CD4+T細胞為主的細胞，T細胞及其特異性細胞因子在外分泌腺中顯著增多，提示其在干燥綜合征發(fā)病機制中起到重要作用［2］，其中IL?17、IFN?γ通過多種炎性通路影響干燥綜合征疾病病理過程，為發(fā)病過程中重要的影響因子。其中，細胞因子IFN?γ是人類免疫系統(tǒng)調節(jié)的關鍵調節(jié)劑，在自身免疫反應中發(fā)揮著重要的作用［4］。在pSS患者眼結膜及唾液腺組織中發(fā)現(xiàn) IFN?γ mRNA以及血清IFN?γ的高表達，并且其與T細胞浸潤程度相關［5］。IFN?γ在干燥綜合征模型和人類外分泌腺組織結構和分泌功能的破壞中起到至關重要的作用，可能與其誘導外分泌腺細胞凋亡、死亡和組織結構的改變有關［6］；IFN?γ調節(jié)趨化因子配體通路，從而促進炎性細胞在靶器官中聚集，啟動異常免疫反應［7］。

圖4～5 艾拉莫德干預對NOD小鼠頜下腺組織病理分級情況進行評價Fig.4～5 Effect of Iguratimod on salivary gland pathology grade in NOD mice

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，CD4+記憶效應T細胞亞群Th17家族，包括6個成員，特別是IL?17A能夠起始強大炎癥反應和誘導產(chǎn)生潛在的前炎性細胞因子，促進局部炎癥反應［8］。在實驗性干燥綜合征小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，IL?17A敲除的小鼠未表現(xiàn)出相應癥狀和組織病理學改變，而將Th17細胞過繼轉移至IL?17A敲除的小鼠體內，迅速誘導出SS樣癥狀，且IL?17A能有效驅動B細胞的激活和成熟，最終導致抗體反應的增強［9］。IL?17A與淋巴細胞浸潤程度和臨床參數(shù)相關，隨著淋巴細胞浸潤程度的增加，IL?17A的密度增加。IL?17+單核細胞在導管周圍浸潤程度與腺體損害程度以及淋巴細胞浸潤灶等級分數(shù)呈直接相關性，IL?17A mRNA越高，損傷越嚴重［10］。其可能的機制為IL?17A通過核因子-κB（nuclear factor?κB，NF?κB）信號通路，損害腺體組織細胞緊密鏈接屏障的完整性，導致外分泌腺功能缺失［11］。多項動物實驗表明通過抑制IL?17、IFN?γ可有效改善淋巴細胞浸潤等異常病理變化以及外分泌腺分泌情況［9］。

艾拉莫德是國家食品藥品監(jiān)督管理局臨床批準的Ⅰ類新藥，于2011年8月獲得我國食品藥品監(jiān)督管理局批準，用于治療成人活動性RA。其化學名為 N?［3?（甲酞胺基）?4?氧?6?苯氧基?4H?1?苯并毗喃?7?基］甲烷磺酰胺［12］。艾拉莫德不僅能選擇性抑制環(huán)氧化酶-2（COX?2），還能抑制IFN?γ，IL?1、IL?6、TNF?a、IL?17 等細胞因子及免疫球蛋白（IgM、IgG）的產(chǎn)生，顯著降低炎癥反應［13］。目前國內外有大量艾拉莫德治療類風濕性關節(jié)炎相關研究，其抑制的相關炎癥通路與干燥綜合征發(fā)病機制過程中炎性機制有相似性［14-15］，故理論上艾拉莫德可用于干燥綜合征治療，且目前艾拉莫德試用于治療干燥綜合征收到了確切療效［3］。但具體治療機制以及療效情況有待進一步研究。本實驗通過艾拉莫德對干燥綜合征模型小鼠干預后相關指標改變的相關研究，從多發(fā)面探究艾拉莫德對干燥綜合征是否有治療效果以及可能的治療靶點，為尋求安全有效的新型治療藥物提供依據(jù)。艾拉莫德為水難溶性藥物，而羧甲基纖維素鈉借助羧甲基纖維的增黏性及少量電荷而形成一種空間網(wǎng)絡結構，起到了很好的助懸作用。將艾拉莫德加入到混懸介質5%羧甲基纖維素鈉溶液中混合均勻制成混懸劑，保證了藥物的均勻分布，可以增加其口服后在胃腸道分布面積，使吸收徹底，提高生物利用度。根據(jù)流變學及沉降體積比等參數(shù)，可知該制劑的穩(wěn)定性良好。

非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠屬于自發(fā)胰島素依賴型糖尿病傾向的小鼠，它同時也是理想的自發(fā)性干燥綜合征小鼠模型。它早期就會出現(xiàn)口干、飲水量增加的臨床表現(xiàn)，以及血清中自身抗體滴度的升高，病理檢測發(fā)現(xiàn)NOD小鼠外分泌腺體中存在淋巴細胞浸潤，隨著年齡增長，浸潤度也逐漸變大［16］。呈現(xiàn)出與干燥綜合征患者相似的免疫調節(jié)紊亂，病理學改變及臨床表現(xiàn)，并有明顯血清學抗體水平顯著升高。頜下腺呈現(xiàn)組織破壞并伴有以Th17細胞為主的大量淋巴細胞浸潤，且外周血有大量炎性因子分泌水平升高，包括IL?17及IFN?γ。其大量淋巴細胞浸潤外分泌腺大約于12～16周齡時，且在雌性小鼠中發(fā)生率達60%～80%［17］。所以它被認為比較適合研究SS的動物模型。而C57BL/6為非易發(fā)病小鼠，必須經(jīng)頜下腺勻漿或蛋白提純物等實驗性誘導后可建立干燥綜合征模型小鼠［9］，故C57BL/6小鼠可作為正常對照組。

該實驗中，予目前較成熟的干燥綜合征動物模型鼠（NOD小鼠）為研究對象，并以非易感干燥綜合征小鼠C57BL/6為正常對照組，予不同濃度艾拉莫德灌胃治療，檢測小鼠的飲水量、進食量、體重指標變化情況。并于6周后，對各組小鼠的頜下腺組織進行HE染色病理觀察淋巴細胞浸潤情況及病理分級評價，血清檢測以IL?17、IFN?γ為代表的炎性因子的變化情況，了解艾拉莫德對干燥綜合征炎性反應及外分泌腺功能影響。

實驗結果顯示，艾拉莫德能有效改善小鼠的外分泌功能，予艾拉莫德治療小鼠的外分泌腺體中淋巴細胞浸潤灶明顯減輕，并減輕炎性因子的產(chǎn)生，特別是IL?17，因此具有保護腺泡組織結構的完整性及分泌功能。且艾拉莫德2組較低艾拉莫德1組效果更顯著，這為臨床應用艾拉莫德治療干燥綜合征提供必要的理論依據(jù)。該實驗中，檢測各組小鼠血清IFN?γ并未出現(xiàn)明顯的改善，模型組與空白組也未出現(xiàn)明顯差異，考慮IFN?γ在干燥綜合征模型小鼠外周血中出現(xiàn)較IL?17晚，且培養(yǎng)小鼠周齡較小，炎癥反應并未達到理想程度。可在后續(xù)實驗中進一步增加實驗周期，并監(jiān)測不同周齡的炎性因子指標變化，外分泌腺淋巴細胞浸潤情況，以及艾拉莫德干預影響。同時此次實驗需進一步設置較高劑量組（50 mg/kg）甚至高劑量組（90 mg/kg），從而進一步探究其療效是否具有劑量依賴性關系，同時可探究其高劑量毒性及半數(shù)致死量情況。

本實驗初步證實了艾拉莫德可抑制干燥綜合征模型小鼠（NOD小鼠）外分泌腺淋巴細胞浸潤情況，減輕模型鼠血清中炎性因子生成，保護腺泡組織結構的完整性及分泌功能，明顯改善小鼠的外分泌腺分泌功能及生存質量。說明艾拉莫德具有抗干燥綜合征模型小鼠外分泌腺炎癥作用，為臨床應用艾拉莫德治療干燥綜合征提供了基礎理論依據(jù)。