，*，，，，，，，，

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省草原技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730010)

土壤中的溶磷微生物可以通過(guò)不同的溶磷途徑，間接為植物生長(zhǎng)提供可溶性磷，進(jìn)而有效促進(jìn)作物生長(zhǎng)[1]。Karlidag等[2]研究發(fā)現(xiàn)，將溶磷菌株BacillusM3、BacillusOSU-142混合施用，可以將蘋(píng)果樹(shù)土壤中的磷含量顯著提高39.9%；Franco-Correa等[3]從三葉草根際土壤篩選出具有較強(qiáng)溶磷能力的鏈霉菌(Streptomyces)，能夠顯著促進(jìn)三葉草植株的生長(zhǎng)和氮素的固定；江紅梅等[4]從向日葵(Helianthusannuus)根圍土壤樣品中篩選出的日本曲霉(Aspergillusjaponicus)，能將土壤難溶磷高效轉(zhuǎn)化為有效磷，對(duì)水稻(Oryzasativa)生物量最大增加率達(dá)268.28%,玉米(Zeamays)盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)生物量的提高效果優(yōu)于對(duì)照,花生(Arachishypogaea)經(jīng)菌劑處理植株鮮重、干重分別增加43.92%和27.67%；Park等[5]發(fā)現(xiàn)，溶磷菌通過(guò)釋放有機(jī)酸降低土壤pH值，同時(shí)固定鉛污染土壤中的鉛，可促進(jìn)作物的生長(zhǎng)；薛冬等[6]在牡丹(Paeoniasuffruticosa)根際分離得到的溶磷放線菌株P(guān)SPSA1在改善牡丹根際土壤磷素營(yíng)養(yǎng)及開(kāi)發(fā)微生物磷肥方面具有重要指導(dǎo)作用。此外，將具有溶磷特性的植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)菌肥施用于草莓(Fragaria×ananassa)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、青稞(Hordeumvulgare)和大蒜(Alliumsativum)中，均都取得了較好的應(yīng)用效果[7-10]。目前很多研究表明，植物根際土壤中存在多種溶磷微生物，學(xué)者們對(duì)溶磷微生物溶磷機(jī)理研究的側(cè)重點(diǎn)不盡相同，發(fā)現(xiàn)的溶磷微生物溶磷機(jī)理也各不相同[11-12]。分泌有機(jī)酸是溶磷微生物溶磷的主要途徑之一，分泌的有機(jī)酸種類主要有：乙酸、丙二酸、草酸、乳酸、丁酸、丙酸、葡萄糖酸、檸檬酸、酒石酸、蘋(píng)果酸等[13-16]，這幾類有機(jī)酸分泌到土壤中會(huì)使土壤酸度增加，有效促進(jìn)土壤中難溶性磷酸鹽的轉(zhuǎn)化和吸收，進(jìn)而促進(jìn)作物生長(zhǎng)。趙小蓉等[17]從玉米根際和非根際土壤中分離得到74株溶磷微生物發(fā)現(xiàn)不同菌株分泌有機(jī)酸的數(shù)量和種類差異很大。王丹等[18]研究芽短梗霉F4產(chǎn)生的有機(jī)酸主要為草酸、檸檬酸和酒石酸，其中以草酸為主。Yi等[19]在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)溶磷菌株產(chǎn)生的胞外多糖能夠顯著增強(qiáng)菌株的溶磷作用。有研究發(fā)現(xiàn)，分泌的有機(jī)酸既可降低培養(yǎng)基的pH，又能與鈣、鐵、鋁等離子形成螯合物，從而使難溶性磷酸鹽溶解[20]，也有人認(rèn)為培養(yǎng)介質(zhì)的pH降低并不是微生物溶磷的必要條件[21]。因此，本研究以岷山紅三葉(Trifoliumpratense)根際分離篩選的4株優(yōu)良溶磷菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，測(cè)定其溶磷量和分泌有機(jī)酸的種類及含量，分析溶磷量與發(fā)酵液pH、分泌有機(jī)酸種類、含量間的相關(guān)性，以期為紅三葉根際溶磷菌株的溶磷代謝途徑提供前期研究基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于甘肅省定西市岷縣岷山紅三葉培育基地，屬于典型的高寒陰濕區(qū)，適宜岷山紅三葉生長(zhǎng)，是我國(guó)岷山紅三葉的主要培育區(qū)和種植區(qū)。海拔2493 m，年均降水量約為700 mm，無(wú)霜期112 d，年均氣溫5.8 ℃，年均日照2228.6 h。試驗(yàn)區(qū)土壤為亞高山草甸土，土壤pH為7.4～7.8，有機(jī)質(zhì)含量11.8 g·kg-1，有效氮95.05 mg·kg-1，有效磷7.32 mg·kg-1，有效鉀182.8 mg·kg-1。

1.2 材料

1.2.1供試菌株 2013年5和7月，分兩次從岷山紅三葉根際分離篩選出優(yōu)良溶磷菌株[22](MHS7、MHS27、MHS30、MHS49)，菌株促生特性見(jiàn)表1。

表1 供試菌株的促生特性Table 1 Growth promoting characteristics of the tested strains

注：“-”表示抑菌率<5%，“*”表示未檢測(cè)。

Note：“-” represents the inhibition rate was less than 5%, “*”represents no detected.

1.2.2培養(yǎng)基 1) LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，氯化鈉 5.0 g，瓊脂 20.0 g，加蒸餾水定容至1.0 L，調(diào)節(jié)pH為7.4。

2) 改良PKOC2培養(yǎng)基[22]：葡萄糖 18.19 g，磷酸鈣 5.0 g，氯化鎂 3.21 g，硫酸鎂 0.25 g，氯化鉀0.2 g，硫酸銨 0.08 g，加蒸餾水定容至1.0 L，調(diào)節(jié)pH至6.8～7.0。

1.3 菌株溶磷量和發(fā)酵液pH測(cè)定

在150 mL的三角瓶中加入50 mL改良PKOC2液體培養(yǎng)基，在121 ℃滅菌20 min，滅菌冷卻后，將各待測(cè)菌株的菌懸液接種至三角瓶中，每個(gè)菌株設(shè)15個(gè)重復(fù)，以不接菌為對(duì)照。接種后將上述三角瓶置于28 ℃，160 r·min-1搖床上振蕩培養(yǎng)13 d，分別在第5、7、9、11、13 d時(shí)，將培養(yǎng)液在4 ℃,8500 r·min-1離心10 min，取上清液，每次3個(gè)重復(fù)。采用鉬銻抗比色法[22]測(cè)定菌液中有效磷增量(扣除對(duì)照組的有效磷增量)，用酸度計(jì)測(cè)定各溶磷菌株發(fā)酵液pH值。

1.4 溶磷菌株分泌有機(jī)酸種類及含量分析

1.4.1有機(jī)酸標(biāo)品圖譜 采用不同有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(乳酸、草酸、丁二酸、蘋(píng)果酸、富馬酸、酒石酸)制備不同梯度有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液，采用高效液相色譜儀(HPLC，Aglient 1260)進(jìn)行測(cè)定分析，各有機(jī)酸保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍見(jiàn)表2。

表2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍Table 2 Retention time, standard curves equation and linear range of each organic acid

1.4.2溶磷菌株分泌有機(jī)酸含量測(cè)定 分別在5、7、9、11、13 d時(shí)，取上述各菌株離心后的上清液，將上清液用0.22 μm針頭式濾器進(jìn)行過(guò)濾。濾液采用HPLC測(cè)定有機(jī)酸種類和含量，每個(gè)菌株設(shè)15個(gè)重復(fù)，每次測(cè)定3個(gè)重復(fù)，進(jìn)樣量為20 μL。色譜條件：分離柱為C18柱(200 mm×4.6 mm)；洗脫緩沖溶液為(NH4)2HPO4。檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；洗脫流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析和作圖，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株溶磷量與培養(yǎng)液pH間的關(guān)系

由圖1可以看出，菌株MHS7培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液pH與溶磷量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3932，P=0.5125)，溶磷量在培養(yǎng)期內(nèi)先逐漸升高，在第9天時(shí)溶磷量達(dá)到最大，后逐漸下降。菌株MHS27溶磷量在培養(yǎng)第7天時(shí)達(dá)到最大，后逐漸下降，pH與溶磷量間呈正相關(guān)(r=0.4252，P=0.4754)。菌株MHS30在5～13 d時(shí)溶磷量逐漸增大，到第13天時(shí)達(dá)到最高值269.5 μg·mL-1。隨著溶磷量的增加，pH逐漸下降，其溶磷量與pH間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.8827，P=0.0474)。菌株MHS49在培養(yǎng)5～11 d時(shí)，溶磷量和pH變化與菌株MHS30基本一致，與11～13 d的變化趨勢(shì)相反。菌株MHS49的溶磷量與pH間呈負(fù)相關(guān)，但差異不顯著(r=-0.8023，P=0.1024)。

圖1 溶磷菌株培養(yǎng)期間溶磷量與pH動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Changes of phosphorus-dissolving capability and pH of strains during culture period

2.2 菌株溶磷能力與分泌有機(jī)酸的關(guān)系

2.2.1溶磷菌株分泌有機(jī)酸種類及含量測(cè)定 采用HPLC法在溶磷菌株培養(yǎng)第5、7、9、11、13天，測(cè)定各菌株培養(yǎng)液中的有機(jī)酸種類及含量。從表3可以看出，菌株MHS27、MHS7、MHS49的培養(yǎng)液中未檢測(cè)到酒石酸，其他種類的有機(jī)酸均能夠檢測(cè)到，包括乳酸、草酸、丁二酸、蘋(píng)果酸、富馬酸。各菌株培養(yǎng)液中，檢測(cè)到的有機(jī)酸種類和含量存在明顯差異。菌株MHS27分泌乳酸的能力最強(qiáng)，是其他菌株的1.16～3.10倍，該菌株分泌草酸和蘋(píng)果酸的能力相對(duì)較高，分泌丁二酸的能力較差。菌株MHS30分泌乳酸能力是其他溶磷菌株的1.2～2.0倍，此外，該菌株分泌富馬酸、丁二酸的能力也是所有溶磷菌株中最好的。菌株MHS7分泌蘋(píng)果酸的能力最好，分泌其他有機(jī)酸的能力處于中上等水平。菌株MHS49產(chǎn)草酸的能力最強(qiáng)，分泌蘋(píng)果酸、丁二酸的能力相對(duì)較好，分泌其他有機(jī)酸的能力較差。由此可見(jiàn)，上述4種高效溶磷菌株分泌有機(jī)酸的種類和含量差異很大，但分泌有機(jī)酸的含量與溶磷菌株溶磷量之間是否存在相關(guān)性，需進(jìn)一步分析。

表3 培養(yǎng)期間溶磷菌株分泌有機(jī)酸含量Table 3 Content of organic acid produced by phosphorus solubilizing strains (mmol·L-1)

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著。

Note: Data are mean±SE. Different letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test.

圖2 培養(yǎng)期間溶磷菌株有機(jī)酸總量 Fig.2 Total organic acids content for strains during culture period

2.2.2溶磷菌株培養(yǎng)液有機(jī)酸總量動(dòng)態(tài)變化 4株溶磷菌株培養(yǎng)期間(0～13 d)分泌有機(jī)酸總量變化情況見(jiàn)圖2。各溶磷菌株中，分泌有機(jī)酸總量較大的是MHS7、MHS27。菌株MHS49和MHS7分泌有機(jī)酸的變化趨勢(shì)較為接近，在培養(yǎng)0～11 d時(shí)，有機(jī)酸總量逐漸增加，在第11天時(shí)，分泌有機(jī)酸總量達(dá)到最大，后逐漸減少。菌株MHS30分泌有機(jī)酸總量在培養(yǎng)期間，逐步呈增加的趨勢(shì)。菌株MHS27分泌有機(jī)酸總量在0～9 d時(shí)，呈先增加后降低的趨勢(shì)，在9～13 d時(shí)，又呈先增加后降低的趨勢(shì)。

2.2.3溶磷量與有機(jī)酸含量的相關(guān)性 為明確各溶磷菌株的溶磷途徑，比較分析了各菌株溶磷量與有機(jī)酸含量間的相關(guān)性(表4)。各菌株培養(yǎng)液中不同有機(jī)酸含量與菌株溶磷量之間的相關(guān)性差異很大。菌株MHS30分泌有機(jī)酸總量與溶磷量間呈極顯著正相關(guān)(r=0.9825，P<0.01)。其余各菌株分泌有機(jī)酸總量與溶磷量間差異不顯著。菌株MHS49溶磷量與分泌乳酸、富馬酸間呈負(fù)相關(guān)(P>0.05)；與分泌丁二酸呈顯著正相關(guān)(r=0.9347，P<0.05)。菌株MHS27溶磷量與分泌蘋(píng)果酸、富馬酸含量間呈負(fù)相關(guān)(P>0.05)；與分泌乳酸之間呈顯著正相關(guān)(r=0.9256，P<0.05)。菌株MHS30溶磷量與分泌酒石酸呈顯著正相關(guān)(r=0.9514，P<0.05)。菌株MHS7溶磷量與分泌有機(jī)酸含量均不顯著。由此可見(jiàn)，不同溶磷菌株溶磷能力的大小與其分泌的有機(jī)酸種類和含量之間的相互關(guān)系存在多樣性，不同溶磷菌株存在不同的溶磷途徑。

表4 菌株溶磷量與有機(jī)酸含量間相關(guān)分析Table 4 Pearson correlation for P solubilization and organic acid content of strain

注：“*”表示在0.05水平上差異顯著，“**”表示在0.01水平上差異顯著。

Note: “*” indicates a significant difference at the 0.05 level, and “**” indicates a significant difference at the 0.01 level.

3 討論

植物根際土壤中存在多種溶磷微生物，不同溶磷微生物的溶磷途徑存在多樣性[11-16,20-21,23]。其中，最常見(jiàn)的溶磷機(jī)制是溶磷微生物通過(guò)分泌有機(jī)酸類物質(zhì)來(lái)溶解難溶性磷。有研究發(fā)現(xiàn)，溶磷微生物溶解無(wú)機(jī)磷是由于溶磷微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生各種有機(jī)酸，有機(jī)酸在降低培養(yǎng)液pH的同時(shí)，能夠與培養(yǎng)液中Fe3+、Ca2+、Mg2+等離子發(fā)生螯合，進(jìn)而使難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性磷[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，岷山紅三葉根際分離獲得的4株高效溶磷菌在培養(yǎng)期間可以分泌草酸、乳酸、蘋(píng)果酸、富馬酸、酒石酸、丁二酸，并且各菌株分泌的有機(jī)酸種類和含量各不相同。菌株MHS30培養(yǎng)期間可以分泌大量有機(jī)酸，該菌株溶磷量與分泌的有機(jī)酸總量顯著正相關(guān)(P<0.01)，與培養(yǎng)期間菌液的pH值顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。這說(shuō)明菌株MHS30可能在培養(yǎng)期間不斷分泌有機(jī)酸類物質(zhì)，提高了培養(yǎng)環(huán)境的酸度，使難溶性磷在酸性條件下發(fā)生溶解。也有可能是分泌出的有機(jī)酸通過(guò)羥基或羧基與磷酸鈣中的Ca2+，Mg2+，Al3+等金屬離子發(fā)生螯合作用，從而將磷酸鈣中的PO43-釋放出來(lái)，這與其他研究結(jié)果相近[26-28]。就菌株MHS30而言，有效磷增量與分泌的有機(jī)酸總量、菌液pH間存在顯著相關(guān)性，但微生物的溶磷機(jī)理非常復(fù)雜，溶磷量并不完全由分泌的有機(jī)酸總量決定，是由于多種因素共同作用的結(jié)果[13]。

分泌有機(jī)酸是溶磷微生物溶磷的重要途徑之一，但并不是溶磷微生物溶磷的唯一途徑，菌株MHS27也可以分泌有機(jī)酸，但是其溶磷量與有機(jī)酸含量之間并沒(méi)有顯著的相關(guān)性，可能存在其他溶磷途徑。有研究發(fā)現(xiàn)溶磷微生物還可以通過(guò)釋放H+來(lái)溶解無(wú)機(jī)磷酸鹽，但是該途徑中的H+并不是微生物產(chǎn)酸得到的。有些溶磷微生物雖產(chǎn)酸能力很差，但具有一定的溶磷能力，這很有可能與釋放質(zhì)子(H+)的溶磷途徑有關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株MHS49產(chǎn)酸能力較差，但是可以溶解磷酸鈣。這可能是該菌株在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)呼吸作用產(chǎn)生了H2CO3，由H2CO3釋放出的H+發(fā)揮了溶磷作用，也有可能是該溶磷細(xì)菌在代謝過(guò)程中吸收了NH4+從而釋放出H+，進(jìn)而產(chǎn)生溶磷作用[30-31]。MHS7的溶磷量不但與分泌的總有機(jī)酸之間沒(méi)有相關(guān)性，且培養(yǎng)液pH與溶磷量呈負(fù)相關(guān)(P>0.05)，說(shuō)明MHS7在培養(yǎng)過(guò)程中起溶磷效果的既不是分泌的有機(jī)酸的影響，也不是pH的改變。畢江濤等[32]研究發(fā)現(xiàn)，微生物可以通過(guò)分泌核酸酶、植酸酶和磷酸酶等物質(zhì)將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的可溶性磷酸鹽，Titball[33]認(rèn)為微生物降解有機(jī)磷或礦物磷等非可溶性磷鹽的能力決定于胞內(nèi)磷水平并受胞外有效磷濃度的影響?？梢?jiàn)分泌有機(jī)酸和pH的改變不是它的溶磷途徑，今后可進(jìn)一步探討其詳細(xì)的溶磷機(jī)理。

本研究中有些菌株分泌有機(jī)酸在培養(yǎng)期間未檢測(cè)到或有機(jī)酸含量變化差異較大，可能是某時(shí)期菌株分泌有機(jī)酸被其他代謝物限制或所受調(diào)控基因表達(dá)差異有關(guān)。李小冬等[34]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析了白三葉(Trifoliumrepens)根際溶磷菌株RW8的溶磷機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，以可溶磷為對(duì)照，在難溶磷條件下，分別檢測(cè)到4782個(gè)基因在RW8中上調(diào)表達(dá)，447個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；在無(wú)磷組中，共檢測(cè)到3630個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，209個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。生物學(xué)過(guò)程主要聚類在代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、單細(xì)胞過(guò)程、刺激應(yīng)答、定位以及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分主要聚類在細(xì)胞組分、細(xì)胞膜、膜組分與高分子配合體等；分子功能主要聚類在催化活性、結(jié)合功能與轉(zhuǎn)運(yùn)功能，這說(shuō)明了溶磷微生物的溶磷過(guò)程非常復(fù)雜，而不是一個(gè)單一生物學(xué)過(guò)程。因此，本研究中4株溶磷菌株的分子生物學(xué)溶磷機(jī)制需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

菌株MHS7、MHS27、MHS30和MHS49均能分泌乳酸、草酸、蘋(píng)果酸、富馬酸和丁二酸，其中菌株MHS30還能夠分泌酒石酸；菌株MHS7和MHS27溶磷量與pH呈正相關(guān)(P>0.05)，與分泌乳酸量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；菌株MHS30溶磷量與pH呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與分泌有機(jī)酸總量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與分泌酒石酸呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；菌株MHS49溶磷量與分泌丁二酸呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；各菌株間分泌有機(jī)酸的種類和數(shù)量差異較大，溶磷菌的溶磷量與總有機(jī)酸量間存在一定相關(guān)性，不同菌株溶磷能力與其分泌的有機(jī)酸種類和含量間的關(guān)系復(fù)雜，不同菌株的溶磷途徑存在差異。