麻黃細辛附子湯6種活性成分提取動態(tài)變化研究

馬學梅，李凌軍，謝慧超，高爽，王玉真，容蓉，楊勇

(山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355)

麻黃細辛附子湯[1]出自東漢張仲景的《傷寒論》，具有扶正解表、溫經(jīng)解表之功效。麻黃發(fā)汗散寒，細辛解表散寒，附子補火助陽，三藥合煎共治陽虛外感之癥[2]。近年來，臨床上有研究報道稱使用該方的三味藥引起中毒和不良反應，煎煮不當是其中的一個重要原因[3]。中醫(yī)臨床上常采用久煎的手段來降低附子烏頭堿毒性，但長時間煎煮藥理活性也逐漸減弱或消失[4-6]，細辛脂素水煎液溶出量低[7]也對全方提取帶來困難。因此，全方煎煮時間的控制是建立規(guī)范化煎煮工藝的關鍵。

本實驗目的在于研究麻黃細辛附子湯全方水提工藝麻黃中的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細辛中的細辛脂素以及附子中的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的提取含量動態(tài)變化，為提取工藝的設計及優(yōu)化提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Technologies 1260 Series高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；BS110S分析天平(北京賽多利斯公司)；New Classic MC 十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多公司)；IKA RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(艾卡(廣州)儀器設備有限公司)；FD-1A-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)。

1.2 材料

本實驗所使用的麻黃(批號：130315)購自泰山中藥有限公司；細辛(批號：16050202)購自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司；黑順片(批號：151008)購自四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司。經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李峰教授鑒定，麻黃為麻黃科植物草麻黃EphedrasinicaStapf.的干燥草質(zhì)莖；細辛為馬兜鈴科植物北細辛AsarumheterotropoidesFi.Schmidt var.mandshuricumKittag.的干燥根及根莖；黑順片為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，按照《中國藥典》2015年版[8]相關項下要求檢查均符合規(guī)定。

鹽酸麻黃堿(純度99.8%，批號：171241-201508)、鹽酸偽麻黃堿(純度99.8%，批號：171237-201509)、苯甲酰新烏頭原堿(純度96.3%，批號：111795-201303)、苯甲酰烏頭原堿(純度97.5%，批號：111794-201304)、苯甲酰次烏頭原堿(純度94.6%，批號：111796-201304)均購自中國食品藥品檢定研究所；細辛脂素(純度98%，批號：Z21D6B7491)購自上海源葉生物科技有限公司。

水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同提取時間煎液的制備

分別稱取麻黃25 g，細辛25 g，黑順片50 g各6份，粉碎為最粗粉，加10倍量水浸泡30 min，分別以20、40、60、90、120、150 min為提取時間節(jié)點。藥液經(jīng)2層紗布濾過，分別減壓濃縮至l mL藥液含1 g復方飲片，標記備用。

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液的制備

分別精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品適量，加甲醇制備成濃度分別為0.540 0、0.410 0 mg·mL-1的對照品儲備溶液。分別精密移取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿儲備液置于同一50 mL容量瓶，甲醇稀釋至刻度，得濃度0.108 0、0.082 0 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿混合對照品儲備液Ⅰ。

精密稱取細辛脂素對照品適量，置50 mL容量瓶，乙腈稀釋至刻度，得濃度0.235 0 mg·mL-1的細辛脂素對照品儲備液。

分別精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對照品適量，加甲醇制備成濃度分別為0.222 3、0.219 0、0.217 7 mg·mL-1的對照品儲備液。分別精密移取對照品儲備液置同一10 mL容量瓶，甲醇稀釋至刻度，得濃度0.066 7、0.065 7、0.065 3 mg·mL-1的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿混合對照品儲備液Ⅱ。

2.2.2 供試品溶液制備

分別精密移取2.1項下各組濃縮液適量，蒸干后用1.44%磷酸水溶液制備成0.012 g·mL-1的供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，作為鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的供試品溶液a1～6。

分別精密移取2.1項下各組濃縮液適量，蒸干后用70%甲醇制備成0.6 g·mL-1的供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，作為細辛脂素的供試品溶液b1～6。

2.3 色譜條件

2.3.1 測定麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的色譜條件

Ultimate Phenyl-Ether 2901.07(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相A為甲醇，B為0.092%磷酸溶液(含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺)，檢測波長210 nm，流速1 mL·min-1,柱溫30 ℃，鹽酸麻黃堿的保留時間為8 min，鹽酸偽麻黃堿的保留時間為10 min，相關色譜峰見圖1～2。

圖1 混合對照品儲備液Ⅰ色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances I

圖2 供試品溶液a1色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample a1

2.3.2 測定細辛中細辛脂素的色譜條件

Kromasil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱；流動相A為乙腈，B為純水，等度洗脫，檢測波長287 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，細辛脂素的保留時間為24.00 min，相關色譜峰見圖3～4。

圖3 細辛脂素對照品儲備液色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of reference substances of asarinin

圖4 供試品溶液b1色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of sample b1

2.3.3 測定附子中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的色譜條件

1苯甲酰新烏頭原堿；2 苯甲酰烏頭原堿；3 苯甲酰次烏頭原堿圖5 混合對照品儲備液Ⅱ色譜圖Fig.5 HPLC Chromatogram of reference substancesⅡ

1苯甲酰新烏頭原堿；2 苯甲酰烏頭原堿；3 苯甲酰次烏頭原堿圖6 供試品溶液c1色譜圖Fig.6 HPLC Chromatogram of sample c1

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍

精密移取2.2.1項下制備的混合對照品儲備液Ⅰ，制備成濃度分別為0.091 8/0.069 7、0.075 6/0.057 4、0.059 4/0.045 1、0.043 2/0.032 8、0.027 0/0.020 5、0.010 8/0.008 2 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿/鹽酸偽麻黃堿混合對照品溶液。

精密移取2.2.1項下制備的細辛脂素對照品儲備液，制備成濃度分別為0.235 0、0.199 8、0.164 5、0.129 3、0.094 0、0.058 9 mg·mL-1的細辛脂素對照品溶液。

精密移取2.2.1項下制備的混合對照品儲備液Ⅱ，制備成濃度分別為0.066 7/0.065 7/0.065 3、0.053 3/0.052 5/0.052 3、0.040 0/0.039 4/0.039 2、0.026 7/0.026 3/0.026 1、0.013 3/0.013 1/0.013 1、0.003 3/0.003 3/0.003 3 mg·mL-1的苯甲酰新烏頭原堿/苯甲酰烏頭原堿/苯甲酰次烏頭原堿混合對照品溶液。

進樣20.00 μL測定，記錄峰面積。分別以各成分峰面積為縱坐標y，以對照品溶液濃度為橫坐標x，得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿回歸方程，分別為y1=46 423x-2.970 5,r=0.999 9,n=6;y2=50 483x+10.722,r=0.999 9,n=6;y3=26 017x+91.474,r=0.999 7,n=6;y4=20609x+15.538,r=0.999 8,n=6;y5=26 475x+15.012,r=0.999 7,n=6;y6=20 544x+2.134 8,r=0.999 9,n=6。鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿線性范圍分別為0.216 0～1.836 0 μg、0.164 0～1.394 0 μg、1.175 0～4.700 0 μg、0.066 7～1.333 4 μg、0.065 7～1.313 2 μg、0.066 5～1.306 6 μg。

2.4.2 精密度實驗

精密移取2.2.1項下制備的混合對照品Ⅰ、細辛脂素對照品、混合對照品Ⅱ稀溶液，分別按照2.3.1、2.3.2、2.3.3項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的相對標準偏差(n=6)分別為0.60%、0.24%、0.26%、2.45%、2.26%、1.89%，表明該儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗

精密移取2.2.2項下制備的供試品溶液，按2.3.1、2.3.2、2.3.3項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進行測定。測得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的相對標準偏差(n=6)分別為0.60%、1.52%、0.73%、1.19%、2.70%、0.67%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性實驗

精密移取2.1項下制備的溶液，分別按照2.2.2項下的制備方法制備供試品溶液，按照2.3.1、2.3.2、2.3.3項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。結(jié)果計算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿含量的相對標準偏差(n=6)分別為0.14%、0.05%、1.65%、2.35%、2.41%、2.36%，表明方法的重復性良好。

2.4.5 加樣回收實驗

精密移取2.1項下已知含量的同一供試品溶液18份，分成3組，分別精密加入2.2.1項下制備的混合對照品儲備液Ⅰ、細辛脂素對照品溶液、混合對照品儲備液Ⅱ適量，再按照2.2.2項下的制備方法制備供試品溶液。分別按照2.3.1、2.3.2、2.3.3項下色譜條件測定，計算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的平均回收率(n=6)分別為99.05%、97.01%、98.55%、103.71%、97.61%、102.98%，表明該方法穩(wěn)定可靠。

2.5 樣品含量測定

精密移取2.1項下制備的各組溶液，分別按照2.2.2項下的制備方法制備供試品溶液，按照2.3.1、2.3.2、2.3.3項下色譜條件進樣分析，計算每克生藥中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量，結(jié)果見表1。

表1 不同煎煮時間活性成分含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of active ingredients in different decocting time

2.6 數(shù)據(jù)分析

應用SPSS 17.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用方差分析中雙因素分析法對各成分不同提取時間溶出量進行分析。分析結(jié)果顯示，F(xiàn)=2.773，P<0.05，有統(tǒng)計學意義，可認為各成分在各煎煮時間點溶出量有顯著性差異。

按照《中國藥典》[8]項下要求對藥材進行含量測定，根據(jù)轉(zhuǎn)移率%=供試品含量/藥材含量，對實驗數(shù)據(jù)進行計算，得各藥材的轉(zhuǎn)移率，見圖7 。

圖7 麻黃生物堿、細辛脂素、附子單酯型生物堿轉(zhuǎn)移率曲線圖Fig.7 Transfer curves of ephedrine alkaloids, asarone and monactone alkaloids

對于麻黃中的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿來說，轉(zhuǎn)移率的拐點在90 min達到91.65%。20 min時轉(zhuǎn)移了76.00%，是因為煎煮時間較短，有效成分溶出量相對較少；然后在20～90 min之前轉(zhuǎn)移率逐步上升，90～120 min轉(zhuǎn)移率上升趨勢較緩。120 min之后溶出量反而有所下降。

細辛中細辛脂素轉(zhuǎn)移率的拐點也在90 min，為23.47%。在提取前20 min細辛脂素轉(zhuǎn)移率僅達11.36%，然后在20～90 min之間轉(zhuǎn)移率逐步上升，到90 min時，溶出量達最大。90 min后，細辛脂素溶出總量開始降低。90～120 min細辛脂素總量減少速度較快，120～150 min消減速度有所減慢，但仍是消減趨勢。

附子中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿總?cè)艹隽吭?0 min時轉(zhuǎn)移率達到70.03%，在20～90 min附子單酯型生物堿的溶出量在緩慢上升，轉(zhuǎn)移率最高達77.03%，之后開始下降。

3 結(jié)論與討論

中藥傳統(tǒng)湯劑在煎煮過程中，煎煮時間的長短對煎液的質(zhì)量有非常重要的影響[9]，選擇合適的煎煮時間對提高藥物的臨床療效有現(xiàn)實意義。藥材中有些成分相互之間或與細胞壁之間，存在一定的親和性而有相互吸附的作用。溶劑進入藥材要先解除吸附，才能使有效成分分散于溶劑中。有效成分不斷溶出使細胞內(nèi)外出現(xiàn)濃度差和滲透壓差，促使有效成分溶出。煎煮時間太短，有效成分溶出不完全；反之，長時間煎煮可能會導致大量雜質(zhì)溶出，某些有效成分分解或者轉(zhuǎn)化，含量減少。因此，要根據(jù)藥物的質(zhì)地、有效成分性質(zhì)等因素選擇合適的煎煮時間[10]。

附子水煎液中生物堿含量低，成分復雜，測定方法[11-13]常有相鄰峰和“假陽性峰”的干擾。在固相萃取中，固相對分離物的吸附力比溶解分離物的溶劑更大。當樣品溶液通過吸附劑床時，附子生物堿濃縮在其表面，其他樣品成分通過吸附劑床。通過只吸附生物堿而不吸附其他樣品成分的吸附劑，可以得到高純度和濃縮的附子生物堿。采用陽離子交換固相萃取柱對附子煎液進行富集和精制[14]，獲得了理想的效果，各成分達到基線分離，提高了測定方法的適用性和準確度。

麻黃中的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿為仲胺生物堿，堿性較強。由于偽麻黃堿的共軛酸會形成分子內(nèi)氫鍵，穩(wěn)定性大于麻黃堿，所以偽麻黃堿的堿性強于麻黃堿。二者的分子較小，既可溶于水，又可溶于氯仿，但偽麻黃堿在水中的溶解度較麻黃堿小，本實驗測定結(jié)果也是鹽酸麻黃堿先于鹽酸偽麻黃堿出峰，與文獻報道[15]一致。在煎煮過程中，隨著時間變化二者溶出量的比值(相對標準偏差1.42%,n=6)可認為差異不顯著。麻黃堿類90 min時轉(zhuǎn)移率已經(jīng)達到91.65%，溶出量高。

細辛脂素呈游離型，偏親脂性，難溶于水，所以其在水里的溶解度是有限的，而濃度梯度對提取有顯著影響。因此，當細辛脂素達到溶解平衡后，由于濃度梯度達到動態(tài)平衡，增加提取時間不能提高提取率。有文獻報道[16]，在中藥復方水煎液中細辛脂素含量和單味藥水煎液的含量存在顯著性差異。這說明復方配伍能夠通過增溶原理增加細辛脂素的溶解度?？紤]在后期提取中，細辛可以通過增加煎煮次數(shù)來提高細辛脂素的溶出量。

附子單酯型生物堿含量隨著煎煮時間延長先增后降，這與其他報道[17]相吻合。一般報道稱附子雙酯型生物堿是毒效成分[18]，為了進一步了解附子各生物堿的轉(zhuǎn)化情況可對雙酯型生物堿做進一步考察。

以上數(shù)據(jù)及曲線有不規(guī)則的地方，除了實驗誤差外，認為還有中藥煎煮過程中各種復雜成分相互交錯影響的原因[19-21]，但是并不影響從中得出趨勢。本方中三味藥在煎煮20 min時有效成分溶出明顯低于其他煎煮時間，然后在90 min時有明顯增加，之后出現(xiàn)緩慢增長，120 min后出現(xiàn)消減現(xiàn)象。說明久煎并不能使有效成分絕對增加，長時間加熱會使有些成分發(fā)生分解或者轉(zhuǎn)化，具體轉(zhuǎn)化情況有待進一步研究分析。通過本實驗得出麻黃細辛附子湯合煎90 min時6種活性成分穩(wěn)定存在，同時也使溶出量達到峰值。此外，藥材粒度與加水量對有效物質(zhì)提取的影響亦較大，為進一步增加有效成分溶出總量及提高溶出速度，下一步可對藥材粒度、加水量進行考察。