劉星偉 林志東 李毅

[摘要] 目的 探討新型雌激素受體-G蛋白偶聯(lián)受體與ERα、ERβ在甲狀腺癌組織中的表達特征及其與患者臨床資料的相關性。 方法 選取2014年2月～2017年9月我院普通外科85例甲狀腺乳頭狀腺癌組織標本，平均年齡38.7（23～77）歲，對組織標本進行免疫組化染色，分析甲狀腺癌組織中G蛋白偶聯(lián)受體、ERα及ERβ的表達特征。 結果 甲狀腺乳頭狀癌組織中GPER、ERα及ERβ陽性表達率分別為63.5%、71.8%、67.1%，呈高表達狀態(tài)；但這三種雌激素受體表達的陽性率與患者年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結轉移狀態(tài)、腫瘤大小等無明顯相關；GPER與ERα及ERβ的表達呈正相關。 結論 三種雌激素受體包括G蛋白偶聯(lián)受體、ERα及ERβ均與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是極具研究價值的潛在治療靶點。

[關鍵詞] 甲狀腺癌；雌激素受體；G蛋白偶聯(lián)受體；ERα；ERβ；免疫組織化學

[中圖分類號] R736.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）25-0020-03

[Abstract] Objective To investigate the expression characteristics of novel estrogen receptor-G protein coupled receptors， ERα and ERβ in thyroid carcinoma tissues and their correlation with clinical data. Methods A total of 85 specimens of thyroid papillary adenocarcinoma in the general surgery of our hospital from February 2014 to September 2017 were collected. The average age of patients was 38.7（23-77） years old. Immunohistochemical staining of tissue specimens was performed. Expression characteristics of G protein-coupled receptors， ERα and ERβ in the thyroid cancer tissues were analyzed. Results The positive expression rates of GPER， ERα and ERβ in papillary thyroid carcinoma were 63.5%， 71.8%， and 67.1%， respectively， showing high expression status. However， there was no significant correlation between the positive rates of these three estrogen receptors and age， gender， tumor stage， lymph node metastasis status， tumor size， etc. GPER was positively correlated with ERα and ERβ expression. Conclusion The three estrogen receptors including G protein-coupled receptors， ERα and ERβ are closely related to the occurrence and development of thyroid cancer， and are potential therapeutic targets with great research value.

[Key words] Thyroid carcinoma； Estrogen receptor； G protein-coupled receptor； ERα； ERβ； Immunohistochemistry

研究顯示甲狀腺惡性腫瘤在女性中的發(fā)病率高于男性，可達3～4倍，據(jù)此不難推斷雌激素很可能與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關聯(lián)[1，2]。部分研究證實雌激素可通過與兩個雌激素受體（estrogen receptor）ERα及ERβ的相互作用來表現(xiàn)其生理和病理生理作用，ERα及ERβ是作為配體激活的轉錄因子[3]，一種獨立于核受體ERα和ERβ的新型雌激素受體-G蛋白偶聯(lián)受體-GPER（G protein-coupled estrogen receptor）已被確定為ER家族的新成員，其能夠以較高的親和力結合雌激素，并通過下游級聯(lián)介導反應觸發(fā)對雌激素的反應[4，5]。為探討它們在甲狀腺癌尤其是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma PTC）中的作用，本研究通過免疫組織化學方法檢測85例甲狀腺乳頭狀癌組織中GPER、ERα及ERβ的表達，分析其與PTC臨床病理特征之間的相關性，探討不同雌激素受體與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取我院病理科2014年2月～2017年9月石蠟包埋甲狀腺乳頭狀癌標本85例，組織片厚5 μm，GPER、ERα及ERβ進行免疫組化檢測。所有患者均為我院普通外科住院患者，接受甲狀腺癌手術，臨床及病理資料保存完整。其中男20例，女65例，年齡38.7（23～77）歲。術后送病理科進行切片及染色，由病理醫(yī)師閱片，按TNM腫瘤分期標準將患者分為Ⅰ期41例、Ⅱ期22例、Ⅲ期17例、Ⅳ期5例。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑及儀器包括：二甲苯、中性樹脂、蘇木素、無水乙醇、免疫組化染色試劑盒、鼠抗人ERα單克隆抗體、鼠抗人ERβ單克隆抗體、GPER兔抗人多克隆抗體、DAB顯色劑、精密pH計、光學顯微鏡、光學相機、石蠟切片機、烤片機、撈片機、恒溫烤箱等。

1.3 實驗步驟

二甲苯脫蠟，系列酒精逐級脫水，PBS沖洗→切片浸入檸檬酸緩沖液中，加熱至98℃持續(xù)15 min后冷卻，PBS沖洗→50 μL 3%H2O2，室溫下15 min，PBS沖洗→50 μL封閉山羊血清工作液，37℃孵育15 min→50 μL一抗，PBS空白對照，37℃孵育2 h，PBS沖洗→50 μL羊抗兔IgG溶液，37℃孵育15 min，PBS沖洗→50 μL辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS沖洗→DAB溶液顯微鏡下顯色→蘇木素復染，酒精脫水，中性樹膠封固。

1.4 結果判定

免疫組化結果由2名病理醫(yī)師分別評分，如結果不一致則重新閱片評估。按照染色程度及高倍視野下陽性細胞數(shù)來進行評分：①細胞染色程度：所有細胞均未染色計0分，染色細胞呈弱陽性計1分，呈中等陽性計2分，呈強陽性計3分；②高倍視野下陽性細胞數(shù)：隨機選取腫瘤細胞染色陽性區(qū)域5個高倍視野計數(shù)，計數(shù)不少于100個腫瘤細胞，觀察陽性表達率，不到1%計1分，1%～10%計2分，11%～33%計3分，34%～66%計4分，67%～100%計5分。上述2項評分相加總分為5～8分者計陽性，否則計陰性。

1.5 統(tǒng)計學方法

用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析系統(tǒng)進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗、Fisher精確概率檢驗，相關性采用Spearman相關分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GPER、ERα及ERβ與臨床病理特征的關系

甲狀腺乳頭狀癌組織中GPER、ERα及ERβ陽性表達率分別為63.5%（54/85）、71.8%（61/85）、67.1%（57/85），這三種雌激素受體表達的陽性率與患者年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結轉移狀態(tài)、腫瘤大小等無明顯相關（P>0.05）。見表1。

2.2 GPER表達與ERα、ERβ表達的相關性

GPER在甲狀腺乳頭狀癌中表達與ERα、ERβ呈正相關，兩者相關系數(shù)分別為0.264、0.372（r=0.264，P=0.003；r=0.372，P=0.0015）。見表2。

3 討論

GPER在全身多個器官及組織中廣泛表達，研究顯示其在腫瘤細胞系中常呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，尤其取自侵襲性腫瘤組織的材料[4]。雌激素結合其特異受體可以使靶細胞發(fā)生許多變化，其主要作用途徑有兩條：基因途徑和非基因途徑[6]?；蛲緩街复萍に嘏c其特異性受體結合來促使受體發(fā)生改變，所形成的復合物結合到靶基因啟動子的雌激素反應因子上，激發(fā)共調控蛋白來啟動靶基因轉錄形成信使RNA，進而翻譯蛋白產(chǎn)生作用，這是一個耗時達數(shù)小時的過程。而非基因途徑耗時極短，可在幾分鐘內(nèi)完成。雌激素通過結合細胞質膜上的雌激素受體或其他受體蛋白，導致諸多的細胞變化如多種蛋白激酶級聯(lián)反應激活、鈣離子增加等。這一過程并不是通過新產(chǎn)生的蛋白來完成的，而是與GPER激活有關。這兩個途徑并不是獨立的，它們之間有交叉作用，協(xié)同反應可促進癌細胞的增殖。研究人員通過將人類WRO和FRO甲狀腺癌細胞系中GPER的表達與MCF-7乳腺癌細胞系中GPER陽性的表達[7，8]對比后發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌細胞系與MCF-7細胞系中GPER表達水平非常相似。研究證實鎘能夠通過GPER/ERK/AKT/NF-κB信號通路誘導GPER陽性甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，而阻斷GPER激活后可顯著降低鎘對GPER陽性甲狀腺癌細胞的雌激素樣作用[9]。

大多學者認為甲狀腺組織表達ER，相關研究亦證實甲狀腺癌組織雌激素受體表達率遠高于良性甲狀腺疾病及正常甲狀腺組織。李飛等[10]通過對101例甲狀腺癌組織中雌激素受體表達檢測發(fā)現(xiàn)，GPER、ERα及PR在多種病理類型的甲狀腺癌組織中均可檢測到，且GPER與ERα在組織標本中同時表達的比例較高，說明這兩個受體的表達具有正相關。吳婷婷等[11]證實甲狀腺未分化癌FRO細胞的增殖是由于ERK1/2、PI3K-Akt途徑被激活，正是E2通過GPER來激活完成的。在育齡期的婦女PTC患者中，一般是指18～45歲階段的女性，ERβ1表達較同年齡段男性患者低（P<0.05），而ERβ2表達則高于男性（P<0.05），顯然ERβ的兩個亞型在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用是完全相反的[12]。Tang C等[13]通過研究129例PTC，61例結節(jié)性增生和118例正常甲狀腺組織標本中的GPER1、EGFR和CXCR1蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)這三種分子的蛋白質表達水平在PTC中上調，而且GPER1、EGFR和CXCR1的高蛋白表達與淋巴結轉移（LNM）顯著相關，并得出結論PTC中GPER1、EGFR和CXCR1表達的評估可能有助于預測LNM的風險。Liu J等[14]研究認為，甲狀腺癌組織中尤其是低分化或未分化甲狀腺癌中ERβ陽性表達率顯著降低，這與本研究結果不同。

本研究通過對85例甲狀腺乳頭狀癌組織的檢測發(fā)現(xiàn)，GPER、ERα及ERβ陽性表達率分別為 63.5%、71.8%、67.1%，GPER、ERα及ERβ在甲狀腺癌組織中的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結轉移狀態(tài)、臨床分期等臨床特征無統(tǒng)計學差異（P>0.05），GPER表達陽性率與ERα及ERβ的表達呈正相關，證實了GPER是甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病的重要因素。雖然Chen GG等[15]研究同樣在PTC細胞中檢測到ERα和ERβ的陽性表達，但其認為不同患者的組織表達有差異，絕經(jīng)前的女性甲狀腺癌組織中ERα陽性表達較其他年齡段的女性和男性的表達率均高。盡管目前對于雌激素可能存在的影響PTC發(fā)病的研究并沒有統(tǒng)一結論，而雌激素受體GPER、ERα及ERβ在PTC中的表達檢測也存在不同結果，本研究結果證實GPER、ERα及ERβ在PTC中均有表達，提示雌激素可能通過相應的雌激素受體，刺激甲狀腺細胞生長增殖，參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結果提示GPER作為PTC治療靶點的可能，但具體參與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的機制仍需進一步研究。

[參考文獻]

[1] Rahbari R，Zhang L，Kebebew E. Thyroid cancer gender disparity[J]. Future Oncol，2010，6（11）：1771-1779.

[2] Derwahl M，Nicula D. Estrogen and its role in thyroid cancer[J]. Endocr Relat Cancer，2014，21（5）：T273-T283.

[3] Matthews J，Gustafsson JA. Estrogen signaling：A subtle balance between ER alpha and ER beta[J]. Mol Interv，2003，3（5）：281-292.

[4] Revankar CM，Cimino DF，Sklar LA，et al. A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cell signaling[J]. Science，2005，307（5715）：1625-1630.

[5] Prossnitz ER，Barton M. The G-protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease[J]. Nat Rev Endocrinol，2011，7（12）：715-726.

[6] 張璐，孫永亮，陳實平，等. ER和PR在甲狀腺乳頭狀癌的表達及意義[J]. 基礎醫(yī)學與臨床，2010，30（6）：635-639.

[7] Girgert R，Emons G，Gründker C. Inhibition of GPR30 by estriol prevents growth stimulation of triple-negative breast cancer cells by 17β-estradiol[J]. BMC Cancer，2014，14：935.

[8] Notas G，Kampa M，Pelekanou V，et al. Interplay of estrogen receptors and GPR30 for the regulation of early membrane initiated transcriptional effects：A pharmacological approach[J]. Steroids，2012，77（10）：943-950.

[9] Zhu P，Liao LY，Zhao TT，et al. GPER/ERK&AKT;/NF-κB pathway is involved in cadmium-induced proliferation，invasion and migration of GPER-positive thyroid cancer cells[J]. Mol Cell Endocrinol，2017，442：68-80.

[10] 李飛，羅浩軍，羅平，等. 雌激素受體GPER、ERα和PR在甲狀腺癌組織中的表達及相關性[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2011，33（16）：1691-1694.

[11] 吳婷婷，龍方懿，賈朝莉，等. G蛋白偶聯(lián)受體在雌激素誘導人甲狀腺未分化癌FRO細胞增殖中的作用及其機制[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2011，33（2）：164-168.

[12] Dong W，Li J，Huang Y，et al. Differential expression patterns of estrogen receptor（ER）-β splice variants between papillary thyroid cancer and nodular thyroid goiter[J].Med Sci Monit，2012，18（9）：351-355.

[13] Tang C，Yang L，Wang N，et al. High expression of GPER1，EGFR and CXCR1 is associated with lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol，2014，7（6）：3213-3223.

[14] Liu J，Chen G，Meng XY，et al. Serum levels of sex hormones and expression of their receptors in thyroid tissue in female patients with various types of thyroid neoplasms[J]. Pathol Res Pract，2014，210（12）：830-835.

[15] Chen GG，Vlantis AC，Zeng Q，et al. Regulation of cell growth by estrogen signaling and potential targets in thyroid cancer[J]. Curr Cancer Drug Targets，2008，8（5）：367-377.

（收稿日期：2018-06-06）