蔡丹莉 高 凱,2 陳芝蕓 石占利 徐 華 朱淵紅 戴顯微

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310018

2 寧波明州醫(yī)院有限公司 浙江 寧波 315100

3 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 浙江 杭州 310003

重型急性胰腺炎(SAP)往往并發(fā)多器官功能不全，病死率高達(dá)30%［1］。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，過于強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)與SAP的發(fā)生發(fā)展及病死率密切相關(guān)［2］。Toll樣受體(TLRs)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［3］，急性肺損傷為SAP最先出現(xiàn)的胰外損傷，也是SAP早期死亡的主要原因。相關(guān)研究提示TLR4作為重要的信號分子與SAP的發(fā)病密切相關(guān)，但TLR4與SAP肺損傷的關(guān)系仍不明確。目前TLR9與SAP的研究主要基于病情已經(jīng)發(fā)展到了一定程度，要阻止SAP的發(fā)展，應(yīng)該首先從SAP發(fā)生早期找原因，而急性肺損傷就是SAP最早出現(xiàn)的并發(fā)癥。大黃素（EMO）是生大黃的主要作用成分，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大黃素可以改善SAP大鼠胰腺及肺組織的炎癥，可以促進(jìn)肺組織炎癥細(xì)胞凋亡［4］。為進(jìn)一步探討大黃素防治SAP肺損傷的作用機(jī)制，本研究觀察其對胰腺及肺組織TLR4、TLR9等表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：健康成年雄性SD大鼠56只，體重180～220g，清潔級，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。動物生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）20080033。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑：?；悄懰徕c（ST），由美國Sigma-Aldrich公司提供，批號：BCBF3394V。實(shí)驗(yàn)前臨時以生理鹽水配置成3.5%的ST溶液。EMO（純度＞98%），由上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司提供，批號：1071101108。實(shí)驗(yàn)前臨用時以4%蔗糖脂肪酸酯配成4mg/ml的EMO混懸液。鼠抗TLR4單克隆抗體（批號GR55869-1）、鼠抗TLR9單克隆抗體（批號：GR4585-2）、鼠抗NF-κB/p65單克隆抗體（批號：GR51446-2）為英國Abcam公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，模型組、EMO組各24只及假手術(shù)組8只。除假手術(shù)組僅開腹輕微翻動胰腺即關(guān)腹外，其他2組采用開腹胰膽管逆行注射3.5%牛磺膽酸鈉的造模方法[4］建立SAP肺損傷模型；假手術(shù)組和模型組大鼠在術(shù)前、術(shù)后1h按10ml/kg體重腹腔注射4%蔗糖脂肪酸酯混懸液，EMO組在術(shù)前、術(shù)后1h按10ml/kg體重腹腔注射4mg/ml濃度的EMO混懸液，術(shù)后禁食不禁水，模型組和EMO組大鼠于手術(shù)造模后3h、6h、12h共3個時相點(diǎn)分批處理8只，假手術(shù)組在手術(shù)3h后處理；各處理大鼠麻醉下腹主動脈采血，分離胰腺和肺組織，部分組織經(jīng)中性甲醛固定，脫水后常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化檢測胰腺和肺組織TLR4、TLR9、核因子κB（NF-κB)蛋白表達(dá)，并根據(jù)胰腺和肺組織中陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度和范圍進(jìn)行半定量[5］。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡情況：假手術(shù)組未見死亡；模型組出現(xiàn)了不同程度的活動能力下降，3h、6h、12h時相點(diǎn)分別死亡3只、2只、2只；EMO組各時間點(diǎn)無死亡。

2.2 TLR4、TLR9、NF-κB蛋白在大鼠SAP肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中表達(dá)變化：見圖1。

圖1 SAP大鼠胰腺和肺組織TLR4、TLR9、NF-κB蛋白表達(dá)的動態(tài)變化（±s）

2.3 EMO干預(yù)對SAP肺損傷大鼠胰腺及肺組織中TLR4、TLR9、NF-κB表達(dá)影響：見表1。

表1 EMO干預(yù)對SAP肺損傷大鼠胰腺和肺組織中TLR4、TLR9、NF-κB蛋白表達(dá)影響（±s）

表1 EMO干預(yù)對SAP肺損傷大鼠胰腺和肺組織中TLR4、TLR9、NF-κB蛋白表達(dá)影響（±s）

注：與同一時間點(diǎn)模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。

分組模型組3h EMO組3h模型組6h EMO組6h模型組12h EMO組12h胰腺組織肺組織只數(shù)NF-κB 2.10±0.22 2.25±0.53 2.67±0.26 3.31±0.46*3.17±0.61 2.46±0.47*5 8 6 8 6 8 TLR4 1.90±0.22 1.81±0.46 2.00±0.45 2.69±0.53*2.92±0.58 2.22±0.25**TLR9 2.35±0.42 2.38±0.35 2.17±0.41 2.88±0.35*3.08±0.58 2.43±0.42*NF-κB 2.60±0.22 2.69±0.26 2.83±0.41 3.34±0.32*3.75±0.42 2.88±0.64*TLR4 2.20±0.57 2.18±0.37 2.67±0.41 3.31±0.26**3.33±0.52 2.56±0.32*TLR9 2.30±0.76 2.18±0.70 2.25±0.69 2.75±0.27 3.25±0.52 2.56±0.50*

3 討論

急性肺損傷是SAP最早出現(xiàn)的胰外并發(fā)癥，是SAP早期的重要死亡原因，其發(fā)生于炎癥反應(yīng)有關(guān)。TLR4與TLR9均為TLRs的主要成員，前者主要識別病原微生物表面某些共有的特定分子結(jié)構(gòu)；后者主要識別胞質(zhì)中病毒雙/單鏈RNA和胞質(zhì)中細(xì)菌或病毒非甲基化cpG DNA，兩者均可通過My D88依賴性途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化NF-κB，并調(diào)控腫瘤壞死因子-α、白介素-1β等炎癥因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。結(jié)合前期研究結(jié)果提示，SAP時胰腺和肺組織的TLR4、TLR9信號通路已被激活并發(fā)揮作用；同時，造模后可能首先啟動胰腺組織的TLR4、TLR9信號通路，激活NF-κB造成胰腺組織的炎癥反應(yīng)；隨疾病的進(jìn)展，進(jìn)一步啟動肺組織的TLR4、TLR9信號通路，引起肺組織炎癥和損傷。

大黃為常用中藥，東漢張仲景《傷寒雜病論》中記載含有大黃的大承氣湯[6]、大黃牡丹湯等經(jīng)典方劑，在當(dāng)今臨床治療SAP均取得不錯療效。EMO是大黃的一種主要成分。本研究發(fā)現(xiàn)，EMO能夠降低SAP肺損傷模型大鼠的死亡率，隨著時間的延長，EMO組大鼠胰腺及肺組織TLR4、TLR9、NF-κB的表達(dá)呈現(xiàn)先增加后下調(diào)的趨勢，提示EMO抗SAP肺損傷的機(jī)制可能是通過抑制炎癥相關(guān)分子的表達(dá)，阻斷如TLR4和TLR9等炎癥表達(dá)的信號分子，從而起到對抗炎癥損傷，保護(hù)機(jī)體的作用。