中國(guó)蓮P1B -ATPase亞家族成員的生物信息學(xué)分析

毛立彥， 龍凌云， 謝振興， 於艷萍， 丁麗瓊， 黃秋偉， 賓振鈞， 金 剛

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001)

近年來，隨著工農(nóng)業(yè)的飛速發(fā)展，農(nóng)藥化肥的過度施用、礦區(qū)的不合理開采以及工廠產(chǎn)生的重金屬?gòu)U渣、廢液的不合理排放，致使Cd、Zn、Cu、Pb、Co等重金屬及其有毒化合物大量滲入水體，水體重金屬污染問題日益嚴(yán)重，已引起世界范圍廣泛關(guān)注[1-5]。水體中重金屬的超標(biāo)不僅會(huì)污染自然環(huán)境，同時(shí)還會(huì)誘發(fā)各種疾病，對(duì)人體健康造成直接或間接危害。重金屬污染水體的修復(fù)工程任務(wù)艱巨，以往采用的物理或化學(xué)修復(fù)手段投資巨大且效果不佳，而大型水生植物生長(zhǎng)速度快，生物量大，易于人工栽培管理，且可作為較好的景觀觀賞材料，將其用于治理水體重金屬污染可降低投資成本，提高治理效率，并能獲得良好的環(huán)境生態(tài)效益[6]，因此，探明大型水生植物對(duì)重金屬的耐受性和富集機(jī)制，提高它們對(duì)重金屬的耐受和富集能力，實(shí)現(xiàn)大型水生植物修復(fù)水體重金屬污染的綜合開發(fā)利用已成為當(dāng)今環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

P1B-ATPase蛋白(P1B型ATPase蛋白，別稱heavy metal transporting ATPase，簡(jiǎn)稱HMA)屬于P型ATPase蛋白家族中的一個(gè)亞家族，也是該家族中唯一參與重金屬陽離子穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可通過水解ATP跨膜運(yùn)輸金屬陽離子，選擇性吸收和運(yùn)輸植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的金屬離子(Cu+、Cu2+、Zn2+、Co2+)以及一些非必需重金屬離子(Cd2+、Pb2+)，在重金屬的抗性、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要作用，是植物修復(fù)重金屬污染水體和土壤不可或缺的組成部分[7-8]。低等、高等植物中存在多個(gè)P1B-ATPase蛋白，廣泛分布于植物細(xì)胞的質(zhì)膜、葉綠體、液泡膜、高爾基體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)上[9-11]。關(guān)于植物P1B-ATPase蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究，現(xiàn)主要集中在擬南芥、水稻、大麥、大豆等模式植物上，已有研究證實(shí)擬南芥(Arabidopsisthaliana)含有8個(gè)P1B-ATPase蛋白(AtHMA1-8)[12-13]，水稻(Oryzasativa)中有9個(gè)(OsHMA1-9)[14]，大麥(Hordeivulgaris)中有10個(gè)(HvHMA1-10)[15]，大豆(Glycinemax)中發(fā)現(xiàn)9個(gè)(GmHMA1-9)[16]。此外，有研究者還從甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)、鼠耳芥(Arabidopsishalleri)、遏藍(lán)菜(Thlaspicaerulescens)等植物中分別克隆獲得P1B-ATPase蛋白成員BnHMA1、AhHMA4、TcHMA4的編碼基因[17-20]。目前已報(bào)道的高等植物P1B-ATPase蛋白多存在于陸生植物中，該類蛋白在水生植物中的相關(guān)研究較少，在睡蓮科(Nymphaeaceae)水生植物中尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。睡蓮科植物是多年生水生植物，共有蓮屬(NelumboGaertn.)、睡蓮屬、芡實(shí)屬、王蓮屬等9個(gè)屬，不同屬內(nèi)均具有較多種類的大型水生植物物種，如睡蓮(Nymphaeatetragona)、中國(guó)蓮(Nelumbonucifera)、荷花等，它們均具有抗性強(qiáng)、分布廣、生長(zhǎng)量大和繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)還具有較高的觀賞價(jià)值，可作為修復(fù)水體重金屬污染的植物材料，能起到兼顧水體污染修復(fù)和景觀改造的功能，具有較廣泛的應(yīng)用前景。目前，睡蓮科蓮屬的中國(guó)蓮基因組測(cè)序工作已完成[21]，全基因組測(cè)序結(jié)果已公開，大量遺傳信息的獲得為系統(tǒng)解析睡蓮科植物的水體重金屬修復(fù)機(jī)制、促進(jìn)睡蓮科植物在水體修復(fù)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本研究采用生物信息學(xué)方法，對(duì)中國(guó)蓮(N.nucifera)可能存在的P1B-ATPase蛋白亞家族成員進(jìn)行預(yù)測(cè)并利用生物信息學(xué)軟件分析其系統(tǒng)進(jìn)化地位、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和保守結(jié)構(gòu)域等特點(diǎn)，以期為進(jìn)一步揭示中國(guó)蓮等大型水生植物P1B-ATPase蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白亞家族序列的獲取和確定

試驗(yàn)地點(diǎn)位于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所實(shí)驗(yàn)室，于2017年9月從中國(guó)蓮全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//lotus-db.wbgcas.cn/)下載所有已注釋的蛋白序列，以FASTA格式保存，根據(jù)擬南芥、水稻基因組中已鑒定的P1B-ATPase蛋白成員的保守基序和結(jié)構(gòu)特征[7]，從下載的中國(guó)蓮數(shù)據(jù)庫(kù)已翻譯的蛋白序列中刪除不含P1B-ATPase蛋白成員保守基序和結(jié)構(gòu)特征的冗余序列，最終篩選出中國(guó)蓮中符合P1B-ATPase蛋白特征的目的序列。

1.2 中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和模體識(shí)別

利用多序列比對(duì)工具Clustal X對(duì)中國(guó)蓮、擬南芥、水稻的P1B-ATPase蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并用GeneDoc軟件查看比對(duì)序列的保守基序。采用MEGA 5.0軟件中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過隨機(jī)逐步比較的方法搜索最佳系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)生成的系統(tǒng)樹進(jìn)行Bootstrap校正。同時(shí)，利用MEME program3(http：//meme-suite.org/tools/meme)模體檢索工具識(shí)別中國(guó)蓮、擬南芥、水稻的P1B-ATPase蛋白所共有的模體，并對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行修改，將模體數(shù)最大值調(diào)整為5個(gè)，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。

1.3 中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白序列分析

利用瑞士生物信息學(xué)研究所提供的ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)程序，對(duì)上述4種蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)目、組成、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等理化性質(zhì)進(jìn)行在線分析。利用Plant-mPLoc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)分析蛋白亞細(xì)胞定位。利用ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale/)分析蛋白親/疏水性。利用TMHMM在線程序(http：//www.sacs.ucsf.edu/cgi-bin/tmhmm.py)預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，并用TOPO2在線程序(http：//www.sacs.ucsf.edu/cgi-bin/open-topo2.py)顯示跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。利用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Swiss-Model(https：//www.swissmodel.expasy.org/)分析蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白成員的篩選和命名

通過對(duì)擬南芥、水稻等已知的P1B-ATPase蛋白亞家族成員序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，依據(jù)已知P1B-ATPase蛋白成員的序列長(zhǎng)度范圍，剔除獲取的中國(guó)蓮蛋白模型中氨基酸數(shù)目<400個(gè)或>1 500個(gè)的冗余序列，并將獲得的非冗余序列與擬南芥、水稻已知P1B-ATPase蛋白進(jìn)行比對(duì)，依據(jù)該亞家族成員序列中高度保守的DKTGT、GDGxNDxP、TGE、C/SPx、HP等保守基序進(jìn)行篩選，最終獲得4個(gè)中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白，分別命名為NnHMA1、NnHMA2、NnHMA3、NnHMA4(表1)。

表1 中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白成員信息

2.2 中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白系統(tǒng)進(jìn)化和保守序列分析

對(duì)擬南芥、水稻、中國(guó)蓮中21個(gè)P1B-ATPase蛋白進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1-A)，分析發(fā)現(xiàn)，這21個(gè)蛋白可聚類為2個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支。植物中存在多種P1B-ATPase蛋白，目前已鑒定的這類蛋白可根據(jù)金屬底物特異性劃分為2個(gè)亞類，分別為Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+P1B-ATPase(Zn亞類)、Cu+/Ag+P1B-ATPase(Cu亞類)[7，15]，其中AtHMA1、AtHMA2、AtHMA3、AtHMA4屬于Zn亞類，而AtHMA5、AtHMA6、AtHMA7、AtHMA8屬于Cu亞類[9]；水稻OsHMA1、OsHMA2、OsHMA3屬于Zn亞類，OsHMA4、OsHMA5、OsHMA6、OsHMA7、OsHMA8、OsHMA9屬于Cu亞類[1，14]。從圖1-A可以看出，中國(guó)蓮的NnHMA1屬于Zn亞類，NnHMA2、NnHMA3、NnHMA4屬于Cu亞類。模體分析結(jié)果(圖1-B)顯示，供試的21個(gè)蛋白均含有模體1和模體2，預(yù)測(cè)NnHMA1、NnHMA2、NnHMA3含有的模體與其所屬進(jìn)化分支中擬南芥、水稻的P1B-ATPase蛋白成員含有相似模體，而NnHMA4與其所屬進(jìn)化分支上的擬南芥、水稻P1B-ATPase蛋白相比，缺少模體4和模體5，推測(cè)這可能是由于在進(jìn)化過程中，NnHMA4蛋白編碼基因出現(xiàn)部分序列缺失所致。此外，利用GeneDoc軟件對(duì)擬南芥、水稻和中國(guó)蓮3個(gè)物種中的P1B-ATPase蛋白進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)掘保守基序，從圖2可以看出，獲得的中國(guó)蓮4個(gè)蛋白均含有植物P1B-ATPase蛋白所特有的DKTGT、TGE、C/SPx、HP等保守基序，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究預(yù)測(cè)的NnHMA1、NnHMA2、NnHMA3、NnHMA4等4個(gè)蛋白屬于植物P1B-ATPase蛋白亞家族成員。與其他序列相比，NnHMA4不含有GDGxNDxP保守序列，推測(cè)該蛋白在進(jìn)化過程中，該部分序列出現(xiàn)缺失或插入的現(xiàn)象。

2.3 中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

對(duì)篩選出的4個(gè)中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果(表2)顯示，中國(guó)蓮的P1B-ATPase蛋白序列長(zhǎng)度為762～1 022個(gè)氨基酸，分子量為82 672.23～111 589.13 u，理論等電點(diǎn)為5.17～7.17。4個(gè)P1B-ATPase蛋白的總平均疏水性均為正值，說明它們均為疏水性蛋白，這可能與P1B-ATPase蛋白具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子的功能有關(guān)，其中NnHMA1疏水性最弱，NnHMA4疏水性最強(qiáng)。此外，4個(gè)蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為30.60～38.75，其中NnHMA2最小，表明預(yù)測(cè)的蛋白都相對(duì)穩(wěn)定，可供體外試驗(yàn)進(jìn)行選擇。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，中國(guó)蓮的4個(gè)P1B-ATPase蛋白均位于質(zhì)膜上，進(jìn)一步證明中國(guó)蓮4個(gè)P1B-ATPase蛋白可能為跨膜蛋白，推測(cè)它們具有參與金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。

2.4 中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白親/疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)分析

氨基酸的親/疏水性是蛋白質(zhì)空間折疊的主要驅(qū)動(dòng)力來源之一，不同氨基酸的親/疏水性差異決定了蛋白質(zhì)在折疊過程中可形成親水性表面或疏水性內(nèi)核結(jié)構(gòu)，通常在跨膜區(qū)域內(nèi)會(huì)形成類似的疏水性區(qū)域。通過ProtScal在線程序?qū)χ袊?guó)蓮的4個(gè)P1B-ATPase蛋白進(jìn)行親/疏水性預(yù)測(cè)。如圖3所示，以0為分界線，正值越大表示疏水性越強(qiáng)，負(fù)值越大表示親水性越強(qiáng)，分值的絕對(duì)值在0.5之內(nèi)的氨基酸可定性為兩性氨基酸[22-23]。由圖3中可知，中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白的N端均存在20～60個(gè)數(shù)量不等、親/疏水性得分值<0.5的氨基酸殘基，且NnHMA1和NnHMA4的C端親/疏水性得分值<0.5的氨基酸殘基數(shù)目明顯多于NnHMA2和NnHMA3。此外，蛋白中氨基酸殘基親/疏水性得分值連續(xù)高于1的區(qū)段數(shù)量，NnHMA1有11個(gè)，NnHMA2有8個(gè)，NnHMA3有9個(gè)，NnHMA4有5個(gè)。通常在蛋白質(zhì)親/疏水性預(yù)測(cè)分析過程中，親/疏水性>1.0可判定為跨膜區(qū)，介于0.6～1.0的片段為疑似跨膜區(qū)[22-23]，以此可預(yù)測(cè)蛋白的跨膜區(qū)數(shù)目。

為論證親/疏水性分析的預(yù)測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步利用TMHMM和TOPO2在線程序?qū)Λ@得的4個(gè)中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。由圖4可知，NnHMA1蛋白存在7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，NnHMA2有8個(gè)，NnHMA3有7個(gè)，而NnHMA4僅有5個(gè)，這與圖3親/疏水性預(yù)測(cè)分析的推斷相類似，進(jìn)一步說明經(jīng)本研究預(yù)測(cè)得到的中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白均為跨膜蛋白。中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白均含有2個(gè)大小不一的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)環(huán)，有研究表明，這2個(gè)胞質(zhì)環(huán)是P1B-ATPase蛋白亞家族成員的特有結(jié)構(gòu)，在環(huán)上含有3個(gè)重要的保守結(jié)構(gòu)域，分別為磷酸化位點(diǎn)(P-domain)、脫磷酸化位點(diǎn)(A-domain)、ATP結(jié)合區(qū)域(N-domain)以及多個(gè)保守基序，如DKTGT、GDGxNDxP、S/TGE、HP等[7，10，15，24-28]，這些保守基序在植物P1B-ATPase蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子和水解ATP提供能量過程中起著重要作用[10，27-28]，結(jié)合圖2中保守基序分析結(jié)果進(jìn)一步證明，本研究從中國(guó)蓮基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選確定的NnHMA1、NnHMA2、NnHMA3和NnHMA4屬于P1B-ATPase蛋白。

表2 中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白的理化性質(zhì)參數(shù)和亞細(xì)胞定位

2.5 中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能與生物體的各類生命活動(dòng)密切相關(guān)，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是構(gòu)成三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本單元，探明蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)深入探究蛋白質(zhì)的折疊構(gòu)造和生物學(xué)功能有重要的研究?jī)r(jià)值[29-31]。本研究采用SOPMA在線程序預(yù)測(cè)中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白(NnHMA1、NnHMA2、NnHMA3和NnHMA4)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。由表3可知，4個(gè)中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量均在30%以上，除NnHMA3之外，其他3個(gè)中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量均高于25%；4個(gè)蛋白的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占比例均較低，最高含量不超過11%。二級(jí)結(jié)構(gòu)元件分布情況顯示，4個(gè)蛋白以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，無規(guī)卷曲散亂分布于蛋白結(jié)構(gòu)中。

進(jìn)一步利用同源建模的方法預(yù)測(cè)這4個(gè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。由圖5-A可知，中國(guó)蓮的4個(gè)P1B-ATPase蛋白都主要由α-螺旋、無規(guī)卷曲元件組成，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的4個(gè)蛋白中α-螺旋、無規(guī)卷曲所占比例高的結(jié)果相符合，它們與二級(jí)結(jié)構(gòu)元件在種類及比例上存在較大的相似性，推測(cè)這可能與中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白在進(jìn)化過程中存在較多的保守序列有關(guān)。此外，NnHMA2和NnHMA3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)較相似，說明這2種蛋白在親緣關(guān)系上較近，這與圖1中系統(tǒng)進(jìn)化樹上顯示的結(jié)果一致。NnHMA4的三級(jí)結(jié)構(gòu)與其他3個(gè)蛋白的差異較明顯，結(jié)合圖1中4個(gè)蛋白所含模體的類型和數(shù)量比對(duì)情況，推測(cè)這可能與篩選得到的NnHMA4蛋白的編碼基因在進(jìn)化過程中出現(xiàn)部分序列缺失，導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度較短有關(guān)。

注：藍(lán)色區(qū)域表示α-螺旋，綠色區(qū)域表示β-轉(zhuǎn)角，紅色區(qū)域表示延伸鏈，紫色區(qū)域表示無規(guī)卷曲。

在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型的檢驗(yàn)拉式圖(Ramachandran)中，藍(lán)線內(nèi)是最合理的主鏈二面角Phi(Φ)、Psi(Ψ)分布區(qū)域，紅色線內(nèi)則為可接受區(qū)域，而在紅線之外的區(qū)域則為不合理區(qū)域。如果預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)殘基的二面角Phi、Psi有90%以上落于藍(lán)線內(nèi)，則表示預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)合理，具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。由圖5-B可見，同源建模構(gòu)建的4個(gè)中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白空間結(jié)構(gòu)主鏈二面角Phi、Psi，落于藍(lán)線內(nèi)中心區(qū)域的氨基酸殘基占90%以上，落于紅線內(nèi)的主鏈二面角Phi、Psi亦有9%左右，絕大多數(shù)主鏈二面角Phi、Psi均在正常范圍內(nèi)，僅有少量氨基酸殘基的二面角Phi、Psi落于不合理區(qū)域。從理論上表明，本研究預(yù)測(cè)的4個(gè)中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)是合理可靠的。

3 討論與結(jié)論

P1B-ATPase蛋白是植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬離子過程中的一類重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，已有研究結(jié)果顯示，不同P1B-ATPase蛋白對(duì)重金屬離子的種類具有一定的選擇性，可依據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的特異性將它們劃分為Zn亞類(轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬離子Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+)和Cu亞類(Cu+/Ag+)[28]。本研究通過對(duì)擬南芥、水稻、中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白的保守基序預(yù)測(cè)，同樣將P1B-ATPase蛋白劃分為Zn亞類和Cu亞類，擬南芥的AtHMA1、AtHMA2、AtHMA3、AtHMA4與水稻的OsHMA1、OsHMA2、OsHMA3及中國(guó)蓮的NnHMA1屬于Zn亞類，而擬南芥的AtHMA5、AtHMA6、AtHMA7、AtHMA8與水稻的OsHMA4、OsHMA5、OsHMA6、OsHMA7、OsHMA8、OsHMA9以及中國(guó)蓮的NnHMA2、NnHMA3、NnHMA4屬于Cu亞類。這2個(gè)亞類的P1B-ATPase蛋白均含有一些保守基序，如DKTGT、GDGxNDxP、TGE、C/SPx、HP。有研究表明，P1B-ATPase蛋白的若干保守基序通常位于蛋白的不同結(jié)構(gòu)域中，直接或間接參與該類蛋白的金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，它們的變異可能會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)基因及其編碼蛋白的功能發(fā)生改變[7，10，15，24，26-27]，如DKTGT、GDGxNDxP基序通常位于P1B-ATPase蛋白的大胞質(zhì)環(huán)上的磷酸化位點(diǎn)(P-domain)結(jié)構(gòu)域，與該類蛋白的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力有關(guān)[32-33]，GDGxNDxP基序中的D(天冬氨酸，Asp)殘基影響著蛋白與Mg2+的結(jié)合[34]，TGE基序通常位于小胞質(zhì)環(huán)上的脫磷酸化位點(diǎn)(A-domain)，參與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程[25]，而HP基序一般較為保守，位于ATP結(jié)合區(qū)域(N-domain)，有研究表明，該區(qū)域參與了蛋白與ATP相互結(jié)合的過程，HP基序在此過程中扮演著重要角色[35]。此外，Mills等的研究結(jié)果顯示，C/SPx基序中的Cys(半胱氨酸)對(duì)蛋白的活性起到重要作用，它的突變可以導(dǎo)致P1B-ATPase蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子活性缺失[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)蓮NnHMA4不含有GDGxNDxP基序，但含有上述的其他保守基序，由此推測(cè)，NnHMA4可能不參與Mg2+的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。本研究通過采用中國(guó)蓮、擬南芥、水稻的 P1B-ATPase蛋白的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，3個(gè)物種的P1B-ATPase蛋白明顯聚類為2個(gè)亞類，其中中國(guó)蓮的NnHMA1屬于Zn亞類，中國(guó)蓮的NnHMA2、NnHMA3、NnHMA4屬于Cu亞類，表明依據(jù)序列的相似性程度推斷蛋白的功能具有一定的準(zhǔn)確性。

探明蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)是解析蛋白空間結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)性的關(guān)鍵，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)是一種簡(jiǎn)捷、有效的方法[37]。本研究對(duì)中國(guó)蓮的P1B-ATPase蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，4個(gè)中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白由α-螺旋、無規(guī)卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角4個(gè)元件構(gòu)成，其中無規(guī)卷曲和α-螺旋所占比例之和高于50%，在NnHMA1中無規(guī)卷曲在該蛋白所有二級(jí)結(jié)構(gòu)單元中所占比例最大，NnHMA2、NnHMA3和NnHMA4中均以α-螺旋為主。目前，同源建模、折疊識(shí)別和從頭預(yù)測(cè)法是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)最常用的3種方法[37]。本研究利用同源建模方法對(duì)中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬，由三級(jí)結(jié)構(gòu)圖可知，4個(gè)蛋白以α-螺旋、無規(guī)卷曲為主要結(jié)構(gòu)單元，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果相符合。此外，還發(fā)現(xiàn)不同中國(guó)蓮P1B-ATPase蛋白的序列中雖然存在眾多保守基序如DKTGT、HP等，部分空間結(jié)構(gòu)也存在一定的相似性，但它們的空間整體構(gòu)型存在較大差異，特別是進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的蛋白之間差異更加明顯，這可能與它們所具有的轉(zhuǎn)運(yùn)不同重金屬離子的功能有關(guān)。

已有的關(guān)于植物P1B-ATPase蛋白及其編碼基因的結(jié)構(gòu)和功能等方面研究，目前主要集中在擬南芥、水稻、大麥、大豆等陸生草本植物上，在大型水生植物上的研究投入相對(duì)較少。而大型水生植物在生長(zhǎng)速度、生物量和潛在的景觀效應(yīng)方面具有一定優(yōu)勢(shì)，使其在植物修復(fù)水體重金屬污染方面具有較大的應(yīng)用價(jià)值。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)手段系統(tǒng)預(yù)測(cè)和分析了中國(guó)蓮中可能存在的P1B-ATPase蛋白亞家族成員的基本信息，探討了其結(jié)構(gòu)與重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收等功能的關(guān)系，這些信息為進(jìn)一步探究大型水生植物的重金屬修復(fù)分子機(jī)制提供了理論參考，對(duì)今后開展基因工程育種研究具有重要的指導(dǎo)意義。