王尤軒，王夢雨，李煜博，陶晗，夏楚楚，黃凱美，汪俏梅*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院園藝系/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)控制重點開放實驗室，杭州 310058；2.杭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，杭州 310017）

植物激素生長素（indole-3-acetic acid,IAA）在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用，解析生長素調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，以及生長素與其他植物激素互作調(diào)節(jié)植物生理反應(yīng)的分子機制，是植物激素領(lǐng)域較受關(guān)注的研究方向[1]。Aux/IAA 蛋白、生長素受體轉(zhuǎn)運抑制響應(yīng)蛋白（transport inhibitor response protein 1, TIR1）和生長素響應(yīng)因子（auxin response factor,ARF）在生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。其中，Aux/IAA 蛋白半衰期短，與生長素早期的功能誘導(dǎo)表達存在密切聯(lián)系[3]。在低濃度的生長素環(huán)境中，ARF 和Aux/IAA蛋白形成異源二聚體[4]，并和TPL（topless）蛋白[5]、組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases, HDACs）結(jié)合，遏制ARF 對生長素的響應(yīng)；在高濃度的生長素環(huán)境中，生長素和TIR1受體結(jié)合，生成的SCFTIR1復(fù)合物通過泛素化打破Aux/IAA 蛋白和ARF 蛋白形成的二聚體，同時，蛋白酶降解Aux/IAA 蛋白使ARF重新獲得活性[6]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Aux/IAA基因家族有著重要的生物學(xué)功能，如參與植物應(yīng)對生物脅迫和干旱等非生物脅迫以及激素響應(yīng)。在模式植物擬南芥中，IAA5、IAA6和IAA19阻遏蛋白通過特異性調(diào)控脂肪族芥子油苷表達來影響植物的耐旱性[7]；而IAA8 與ARF6/ARF8 蛋白結(jié)合，通過調(diào)控茉莉酸途徑影響植物的開花和發(fā)育[8]。在番茄果實發(fā)育的早期，Sl-IAA9/SIARF7復(fù)合體和赤霉素生物合成途徑抑制蛋白SlDELLA 共同抑制下游EXP5基因的表達[9]；Sl-IAA27則可以調(diào)控NSP1進而影響?yīng)毮_金內(nèi)酯的合成[10]。此外，OsIAA11可以促進水稻側(cè)根發(fā)育[11]，而桃果實中Aux/IAA與成熟期呼吸躍變關(guān)系密切[12]。雖然Aux/IAA基因家族的功能在一些作物中得到解析，但其在蕓薹屬蔬菜中的鑒定和功能分析研究較少。

芥藍（Brassica oleraceavar. alboglabraBailey）是一種以花薹或嫩葉為食用部位的甘藍類蔬菜。作為一種中國特有的蔬菜，芥藍含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，并因其獨特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)，越來越受到消費者的青睞，從而逐漸發(fā)展成為一種重要的蕓薹屬蔬菜[13]。本文通過對芥藍Aux/IAA基因家族進行生物信息學(xué)分析，以及提供有效數(shù)據(jù)，從而更好地解析芥藍生長素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并為探索Aux/IAA基因家族在芥藍逆境適應(yīng)性中的功能及其潛在應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：芥藍品種為‘芥藍27’，為本實驗室自留種。

試劑：RNAiso Plus試劑盒（日本TaKaRa公司）；三氯甲烷異丙醇；無水乙醇；無RNA酶（RNase free）ddH2O；PrimeScript RT 主混合物（日本TaKaRa 公司）；凝膠純化試劑盒[Omega Bio-Tek（中國）公司]；pEASY載體克隆試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；DH5α感受態(tài)細(xì)胞；質(zhì)粒提取試劑盒[Omega Bio-Tek（中國）公司]；氨芐；Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)液（1 L 培養(yǎng)液中包括10 g NaCl，5 g 酵母抽提物，10 g蛋白胨；固體培養(yǎng)基中加15 g/L瓊脂）；10 μmol/L生長素；10 μmol/L 2，4-表油菜素內(nèi)酯（2,4-epibrassinolide,EBR）；10 μmol/L 脫落酸（abscisic acid,ABA）；160 mmol/L NaCl；TB-Green 嵌合熒光試劑盒（日本TaKaRa公司）。

1.2 芥藍Aux/IAA 基因與氨基酸序列的獲取

在擬南芥基因數(shù)據(jù)庫[The Arabidopsis Information Resource(TAIR),https://www.arabidopsis.org/]中搜索得到擬南芥Aux/IAA基因家族的序列號和基因序列信息。從蕓薹屬植物數(shù)據(jù)庫（BrassicaDatabase，https://brassicadb.org/brad）中找到“syntenic gene”選項并搜索芥藍和擬南芥Aux/IAA基因家族的同源基因，記錄基因和氨基酸序列。

1.3 芥藍Aux/IAA 基因家族的理化性質(zhì)、染色體定位與進化分析

在ExPASy數(shù)據(jù)庫（https://web.expasy.org/prot param/）中找到“ProtParam”選項[14]，對芥藍和擬南芥Aux/IAA 蛋白家族的氨基酸大小、分子質(zhì)量、等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、親水性等基本信息進行查找和記錄。利用Tbtools工具定位Aux/IAA基因在染色體上的位置；利用DNAman 軟件分別對擬南芥、芥藍的基因和氨基酸序列進行多重比對；使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建Aux/IAA蛋白家族系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 芥藍Aux/IAA 家族亞細(xì)胞定位和保守基序（motif）分析

利用在線軟件Wolf（https://wolfpsort.hgc.jp/）對Aux/IAA基因家族進行亞細(xì)胞定位；使用在線軟件MEME（http://meme-suite.org/）將預(yù)測的基序數(shù)目設(shè)置為20，對芥藍Aux/IAA基因家族的保守基序進行預(yù)測與分析。計算基序的期望值（E），如果E＞0.05，說明此結(jié)構(gòu)域未到達顯著水平，并統(tǒng)計E＜0.05 的基序數(shù)目。隨后，將預(yù)測數(shù)目修改成統(tǒng)計的基序數(shù)值再進行一輪預(yù)測，得到預(yù)計結(jié)果。

1.5 芥藍Aux/IAA 基因家族部分成員的實時熒光定量表達分析

在錐形瓶中加入芥藍種子和ddH2O，于28 ℃條件下，在200 r/min搖床中過夜振蕩培養(yǎng)；第2天挑選250粒大小相似、健康的發(fā)芽芥藍種子，均分放置于水培箱中，置于相同培養(yǎng)條件下生長5 d 后進行處理。設(shè)置生長素（IAA）、油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid,BR）、脫落酸（ABA）和NaCl 處理：分別將水培箱中的培養(yǎng)液換成提前配置好的10 μmol/L IAA、BR、ABA 以及160 mmol/L 的NaCl 溶液；于處理后0、1、3、6 h分別收集不同處理下芥藍幼苗的葉片（一次取5～6株），取0 h清水處理下的芥藍幼苗葉片作為對照（CK）；液氮冷凍后置于－80 ℃冰箱中保存。使用RNAiso Plus 試劑盒提取芥藍葉片的RNA，使用PrimeScript RT主混合物試劑盒將上述提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，并用ddH2O 稀釋1 倍。選取芥藍Aux/IAA家族成員基因BoIAA2（第Ⅴ亞族）、BoIAA3-1（Ⅴ）、BoIAA3-2（Ⅰ）、BoIAA4（Ⅴ）、BoIAA5（Ⅲ）、BoIAA9-1（Ⅳ）、BoIAA9-2（Ⅳ）、BoIAA19-1（Ⅲ）和BoIAA19-2（Ⅲ），在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上設(shè)計實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction, qRTPCR）所需的引物（表1），在ABI PRISM Step One PlusTM實時熒光定量PCR系統(tǒng)中使用熒光染料進行qRT-PCR 分析，反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火1 min，35個循環(huán)。其中，以BoActin7為參考基因，以2－△△CT計算其他基因的表達情況。以0 h 清水處理的芥藍葉片為對照，將qRTPCR數(shù)據(jù)統(tǒng)一以對數(shù)2為底處理來制作基因表達熱圖：紅色表示基因表達量升高，綠色表示基因表達量受到抑制。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍Aux/IAA 基因家族的理化性質(zhì)、染色體定位與進化樹分析結(jié)果

從TAIR 和蕓薹屬植物數(shù)據(jù)庫中搜索得到41個芥藍Aux/IAA同源基因，其命名如表2 所示。從中可知：芥藍Aux/IAA 蛋白BoIAA10-1 的氨基酸殘基數(shù)最多，為777，其余蛋白的氨基酸殘基數(shù)都分布在128～427 之間，等電點分布在4.38～9.73 之間。根據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)越大、蛋白質(zhì)越穩(wěn)定的原則，可以看出，最不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)是BoIAA3-2（18.17），最穩(wěn)定的是BoIAA30-1（70.69）。不同蛋白間脂肪指數(shù)的差異也較大，其中BoIAA3-2 的脂肪指數(shù)最大，為123.31，而BoIAA2-1 和BoIAA4-1的脂肪指數(shù)最小，均為60.63。除BoIAA3-2 和BoIAA6-1 具有疏水性外，其余的Aux/IAA 蛋白都為親水性蛋白。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

表2 芥藍Aux/IAA家族信息及理化性質(zhì)Table 2 Information and physicochemical properties of Aux/IAA family in Chinese kale

表2（續(xù)）Continuation of Table 2

芥藍BoIAA基因在染色體上的分布如圖1 所示，34個基因均勻分布于9條染色體上，其中染色體C01和C05上分布的基因最多，有6個。此外，有7個基因（BoIAA4-1、BoIAA8-1、BoIAA9-1、BoIAA15-1、BoIAA16-1、BoIAA16-2、BoIAA18-2）的分布未知。進化樹分析結(jié)果（圖2）表明：芥藍Aux/IAA 家族分成8個亞族，其中，第Ⅷ亞族包含8個蛋白質(zhì)，分別為BoIAA26-1、BoIAA26-2、BoIAA18-1、BoIAA28-2、BoIAA28-1、BoIAA20-1、BoIAA30-1和BoIAA30-2；而第Ⅰ亞族只包含BoIAA3-2和BoIAA18-2這2個蛋白質(zhì)。

2.2 芥藍Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)保守基序（motif）分析和亞細(xì)胞定位

對芥藍Aux/IAA 家族進行亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，大部分基因編碼的蛋白分布于細(xì)胞核、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。其中，在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中均分布著30 個BoIAA 蛋白，且BoIAA 蛋白在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中的分布情況一致。BoIAA32-1 在細(xì)胞中分布的區(qū)域最廣。

保守基序的分析預(yù)測結(jié)果（圖3）和部分基序的結(jié)構(gòu)圖（圖4）顯示，在BoIAA基因家族蛋白質(zhì)保守基序的41 個成員中，最長保守序列基序17 由50 個氨基酸殘基組成，最短保守序列基序10 由10 個氨基酸殘基組成。而BoIAA3-2、BoIAA18-2 和BoIAA10-1 不含有保守基序，其中BoIAA3-2 和BoIAA18-2 都屬于第Ⅰ亞族。轉(zhuǎn)錄因子C 端由基序5、基序11、基序3、基序14 和基序17 這5 種基序組成，其中基序5 的數(shù)目最多，包含1 個功能域Ⅰ，其具有“LxLxL”保守基序。轉(zhuǎn)錄因子N端由基序1、基序4、基序6和基序8這4種基序組成，其中基序1和基序8 數(shù)目最多，而BoIAA9-2 與BoIAA31-1 的N端分別僅由基序6和基序4組成，基序3包含功能域Ⅱ的“GWPPV”保守基序，和Aux/IAA蛋白的穩(wěn)定性相關(guān)[15]；而BoIAA20-1、BoIAA30-1、BoIAA30-2、BoIAA32-1、BoIAA32-2、BoIAA33-1、BoIAA33-2、BoIAA34-1蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ缺失，均不含基序3，其降解能力受到一定的影響?；?包含功能域Ⅳ特有的“GDVP”基序，能加強蛋白的靜電作用[16]。在所有的保守基序中，基序2在每個Aux/IAA基因中的數(shù)目最多，包含功能域Ⅲ的基序。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，有些保守基序為某個亞族所特有，比如基序6僅存在于第Ⅵ亞族中，基序7 僅存于第Ⅶ亞族。以上結(jié)果表明，BoIAA家族不同的基因存在特有的保守基序，而在不同亞族中保守基序的組成也存在很大的差異。

圖1 芥藍Aux/IAA基因家族的染色體定位Fig.1 Chromosome mapping of the Aux/IAA gene family in Chinese kale

圖2 芥藍Aux/IAA蛋白家族系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of Aux/IAA family protein in Chinese kale

2.3 芥藍Aux/IAA 基因家族部分成員在外源植物激素和鹽脅迫處理下的熒光定量表達情況分析

如圖5所示：在10 μmol/L IAA處理下，Aux/IAA基因的表達量變化較大，其中BoIAA3-1、BoIAA19-1的表達量先上調(diào)后下降，BoIAA3-2、BoIAA9-1的表達量先受到抑制后上調(diào)。與對照組相比，在IAA處理后0～3 h 內(nèi)BoIAA2-1和BoIAA19-2表達量顯著升高，4～6 h內(nèi)迅速下降，其中IAA處理3 h后BoIAA2-1的表達量上調(diào)6 倍，BoIAA19-2的表達量上調(diào)9 倍；而IAA 處理6 h 后BoIAA2-1的表達量下調(diào)至對照組的36%。10 μmol/L ABA 處理使BoIAA2-1、BoIAA3-1、BoIAA5、BoIAA19-2、BoIAA9-2的表達水平顯著下降，而BoIAA3-2、BoIAA9-1、BoIAA19-1的表達水平則顯著升高，其中ABA處理6 h后，BoIAA3-2的相對表達量上調(diào)幅度最大，約為對照組的2.8 倍。在10 μmol/L BR 處理下，只有BoIAA9-1和BoIAA9-2的表達量升高，其余基因的表達均受到抑制，且BoIAA3-1、BoIAA3-2、BoIAA4、BoIAA19-1、BoIAA19-2均表現(xiàn)為在BR處理前期表達量升高，在BR處理后期表達量下降。

如圖6 所示：在160 mmol/L NaCl 處理下，BoIAA2-1和BoIAA19-1的表達量極顯著升高，在NaCl 處理3 h 后，BoIAA2-1的表達量上調(diào)了18 倍，BoIAA19-1的表達量上調(diào)了2 倍。在NaCl 處理6 h時，BoIAA3-1、BoIAA9-1、BoIAA4和BoIAA5的表達受到抑制，BoIAA3-1 和BoIAA3-2、BoIAA9-1和BoIAA9-2這2對同源基因的表達量變化趨勢相似，均為先上調(diào)后受到抑制。

圖3 芥藍Aux/IAA家族蛋白質(zhì)保守序列基序分析Fig.3 Analysis of protein conserved sequence motif of Aux/IAA family in Chinese kale

3 討論

Aux/IAA基因家族在植物生長素的響應(yīng)途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。最早從大豆受生長素誘導(dǎo)的基因中分離得到Aux/IAA基因[17]，之后更多物種的Aux/IAA基因家族的理化性質(zhì)及特異性功能得到挖掘與鑒定，包括擬南芥的29個Aux/IAA基因家族成員[18]、玉米的31 個成員[19]、小麥的84 個成員[20]、大豆的63個成員[21]、番茄的26個成員[22]以及三月李的26個成員[23]等。本試驗對中國特產(chǎn)蔬菜芥藍Aux/IAA基因家族進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)芥藍Aux/IAA基因家族由41個成員組成，可分為8個亞族。這與油菜Aux/IAA基因存在7 個亞族的情況[24]大致相符。41個基因大多數(shù)均勻分布于C01～C09 這9 條染色體上，有7 個基因無法在染色體上定位。對BoIAA基因家族進行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，該家族基因多數(shù)在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中都有表達，說明BoIAA家族對植物生理活動有著廣泛的影響。

圖4 Aux/IAA蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of Aux/IAA proteins’conserved domain Ⅰ,Ⅱ,Ⅲand Ⅳ

圖6 部分Aux/IAA基因家族成員在鹽脅迫處理下的定量表達情況Fig.6 Expressions of some Aux/IAA gene family members under salt stress treatments

有研究表明，Aux/IAA 蛋白存在4 個保守的功能域[25]，使用在線軟件MEME 對芥藍BoIAA家族基因進行分析發(fā)現(xiàn)：該家族基因的C 端由5 種基序組成，其中基序5數(shù)目最多，含有功能域Ⅰ的保守基序“LxLxL”，可以招募TPL 輔抑制因子從而影響下游基因的表達[26]；N端由基序1、基序4、基序6和基序8這4種基序組成，基序1數(shù)目最多，含有功能域Ⅳ特有的“GDVP”基序。在所有的保守基序中，基序2在每個Aux/IAA蛋白中數(shù)目最多，包含功能域Ⅲ的基序，能影響ARF和Aux/IAA蛋白的同源或異源二聚化[27]。而功能域Ⅲ、Ⅳ和ARF蛋白羧基末端結(jié)構(gòu)域共同組成PB1 蛋白結(jié)構(gòu)域[28]，能和ARF 蛋白互作調(diào)節(jié)ARF活性?；?包含功能域Ⅱ特有的保守基序，可以直接和SCFTIR1泛素連接酶復(fù)合物互作，影響Aux/IAA 蛋白的降解[29]。功能域Ⅱ的降解子（degron）序列是轉(zhuǎn)錄抑制劑反應(yīng)/生長素F-box（TIR/AFB）蛋白的結(jié)合位點[30]，且降解子序列側(cè)翼基因區(qū)域一些賴氨酸殘基的柔性熱點與TIR1 介導(dǎo)的泛素化相關(guān)[31]。目前發(fā)現(xiàn)，5 種Aux/IAA 蛋白IAA20、IAA30、IAA32、IAA33、IAA34 缺少功能域Ⅱ[32]，導(dǎo)致上述蛋白降解受到影響，而芥藍中的BoIAA20-1、BoIAA30-1、BoIA30-2、BoIAA32-1、BoIAA32-2、BoIAA33-1、BoIAA33-2、BoIAA34-1蛋白均缺少包含功能域Ⅱ序列的基序3，和擬南芥中發(fā)現(xiàn)存在5種Aux/IAA蛋白缺少功能域Ⅱ這一結(jié)果相一致。除了這類非典型Aux/IAA蛋白，芥藍中的24個蛋白包含4個功能域，17個蛋白存在不同程度的功能域缺失。煙草有77個Aux/IAA蛋白，而所有的蛋白都缺少功能域Ⅰ[33]。每個亞族和蛋白都有特殊的保守基序，這些基序的多樣性可能使Aux/IAA蛋白在響應(yīng)過程中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。

本研究中，針對部分BoIAA基因家族成員分別測定其在IAA、ABA、BR和NaCl處理下的實時熒光定量PCR表達情況，發(fā)現(xiàn)芥藍Aux/IAA基因家族成員對外源處理表現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)。在10 μmol/L IAA處理下，BoIAA2-1和BoIAA19-1表達量的變化趨勢相似。在結(jié)球甘藍中對真葉期幼苗葉片進行IAA處理，發(fā)現(xiàn)BoIAA2-1和BoIAA19-1的表達量變化和芥藍中的類似，即IAA 處理后2 個基因的表達量上調(diào)，且在IAA誘導(dǎo)3 h后達到較高值，隨后表達量下降，推測BoIAA2-1和BoIAA19-1可能通過與BoTIR1和BoARF8識別響應(yīng)IAA濃度的變化[34]。在160 mmol/L NaCl脅迫處理后BoIAA2-1和BoIAA19-1的表達量極顯著上調(diào)，其中BoIAA2-1在NaCl 處理后3 h 表達量是對照組的19 倍，表明BoIAA2-1可能直接響應(yīng)并調(diào)控芥藍的抗鹽能力，而BoIAA19-1在NaCl 處理3 h 后表達量是對照組的3 倍，說明BoIAA19-1可能間接調(diào)控芥藍抵御鹽脅迫。這一結(jié)果與在擬南芥中發(fā)現(xiàn)IAA19和MYB 轉(zhuǎn)錄因子互作影響植物非生物脅迫抗逆性的結(jié)論一致。綜上所述，芥藍Aux/IAA基因家族成員在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中發(fā)揮作用，BoIAA基因可以根據(jù)外源激素的變化來調(diào)整自身的表達，通過與其他基因互作的形式影響植物的生命活動，從而實現(xiàn)對外源激素的響應(yīng)，而具體的調(diào)控機制需要后續(xù)深入探究。另外，BoIAA基因在植物響應(yīng)非生物脅迫方面也存在潛在影響，且不同基因家族成員的功能存在差異，通過對不同處理條件下Aux/IAA基因家族成員的表達分析能幫助我們更好地探究BoIAA基因家族在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素響應(yīng)和抗逆性等方面潛在的影響與功能。

4 結(jié)論

本實驗對芥藍Aux/IAA基因家族進行全基因組分析，利用生物信息學(xué)分析的方法挖掘到芥藍有41個Aux/IAA同源基因。利用基序分析發(fā)現(xiàn)，有3 個（BoIAA3-2、BoIAA18-2 和BoIAA10-1）Aux/IAA蛋白家族成員不含保守基序，有8 個（BoIAA20-1、BoIAA30-1、BoIAA30-2、BoIAA32-1、BoIAA32-2、BoIAA33-1、BoIAA33-2、BoIAA34-1）成員缺少包含功能域Ⅱ的基序3，且這8個蛋白成員的穩(wěn)定性較高，不同亞族與基因基序的組成存在很大的區(qū)別。在不同植物激素影響下，定量分析特定BoIAA基因的表達情況發(fā)現(xiàn)，不同成員對植物激素響應(yīng)存在差異。在鹽脅迫處理下，BoIAA2-1和BoIAA19-1的表達量在處理前期顯著上調(diào)，說明在鹽脅迫處理下，這2個基因可能有直接或間接調(diào)控植物抵御鹽脅迫的能力，能夠幫助我們從新的角度分析植物生長和抗性之間的關(guān)系。