隋 明，朱克永,張崇軍,王靜霞，唐賢華,周榮清

(1.四川工商職業(yè)技術學院，四川都江堰 611830；2.四川大學輕紡與食品學院，四川成都 610000)

黃曲霉毒素主要由曲霉屬真菌中黃曲霉菌和寄生曲霉菌在生長過程中產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，主要包括黃曲霉毒素B1、B2、G1等10多種，其中以黃曲霉毒素B1毒性最強。黃曲霉菌廣泛存在環(huán)境中的土壤、植物果實中，主要以發(fā)霉及污染的玉米和花生中黃曲霉毒素含量較高，對人和動物具有致畸、致癌、致突變作用[1-3]。當人攝入過量的黃曲霉毒素時,會引發(fā)人的急性中毒及致癌，當動物采食了含有黃曲霉毒素飼料，導致動物生長性能和生產(chǎn)性能下降，嚴重者出現(xiàn)死亡，食品和飼料中黃曲霉毒素給人和動物的健康造成嚴重的威脅[4-6]。因此，世界各國對食品和飼料中黃曲霉毒素的含量進行嚴格的控制。中草藥種類繁多且富含多種活性成分物質，具有清熱解毒、抑制細菌生長、清除內毒素、低殘留、無毒副作用、使用安全、綠色無害等多種優(yōu)點[7]。國內外關于清熱解毒中藥抑制黃曲霉菌生長特性研究較少，因此，本試驗選用了10種清熱解毒中藥水提物對黃曲霉菌體外生長特性進行研究，測定其對黃曲霉菌菌落生長抑制率、黃曲霉菌孢子生長抑制率和黃曲霉菌產(chǎn)毒量，為進一步研發(fā)去除食品和飼料中黃曲霉菌復方中藥制劑及應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 黃曲霉菌CGMCC3.4408標準菌株由四川工商職業(yè)技術學院食品系實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 黃連、連翹、穿心蓮、金銀花、大青葉、蒲公英、板藍根、射干、紫花地丁、白頭翁10種清熱解毒類中藥購于成都市同仁醫(yī)藥有限公司；PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、產(chǎn)毒培養(yǎng)基，北京奧星生物技術公司產(chǎn)品；AFB1檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海恒科學儀器有限公司生產(chǎn)；全波長酶標儀由德國Eppendourf公司生產(chǎn)；PBST、培養(yǎng)皿、EP管、移液槍、分析天平及分析純等常規(guī)試劑及儀器由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 中藥水提物的藥液的制備 用水提法制備中草藥藥液，將中藥在烘干箱烘干，稱量50 g，加入5倍～10倍的蒸餾水浸泡1 h～1.5 h，煮開后用文火再煎煮30 min，用12層紗布過濾，再加入5倍蒸餾水煮沸，用文火再煎煮20 min過濾藥液。將兩次所煮藥液合并濃縮為每毫升含原藥為1 g。離心后并調整其pH為7.2～7.4，分裝、121℃滅菌10 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黃曲霉菌活化培養(yǎng) 黃曲霉菌CGMCC 3.4408標準菌株取出，在生物安全實驗室進行試驗，將菌株室溫解凍后，在無菌的條件下接種PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4 d～8 d后，挑取單個菌落進行擴大培養(yǎng)。

1.2.3 黃曲霉菌孢子計數(shù) 生物安全實驗室無菌的條件下，取擴大培養(yǎng)的黃曲霉菌培養(yǎng)基，加入一定量的無菌的PBST，將用黃曲霉菌洗脫后，收集到EP管中，用無菌的PBST 8 000 r/min 5 min洗滌3次后，再用無菌紗布過濾3次除去黃曲霉菌孢子的菌絲，進行計數(shù)。用無菌的PBST調整黃曲霉菌孢子濃度為1×107cfu/mL備用。

1.2.4 黃曲霉菌菌落生長抑制率測定 生物安全實驗室無菌的條件下，取不同種類的中藥水提物藥液1 mL分別涂布PDA培養(yǎng)基上，待中藥水提物藥液液體完全被吸收后，在PDA培養(yǎng)基中心按照中藥水提物藥液與黃曲霉菌孢子懸液1∶50比例，接種20 μL黃曲霉菌孢子懸液(1×107cfu/mL)，對照組不添加任何藥物接種等量的黃曲霉菌孢子懸液，28℃恒溫箱進行培養(yǎng)，分別在黃曲霉菌培養(yǎng)后48、72、96 h測量菌落大小。每種中藥水提物做3個重復并3次試驗結果平均值進行統(tǒng)計與計算不同種類中藥水提物對霉菌生長的抑制率。霉菌生長抑制率(%)=(空白對照組菌落直徑-試驗組菌落直徑)/空白對照組菌落直徑×100。

1.2.5 黃曲霉菌孢子生長抑制率測定 在生物安全實驗室中，取2.5 mL的察氏培養(yǎng)基分別加入等量的不同種類的中藥水提物藥液，分別接種500 μL的黃曲霉胞子孢液(1×107cfu/mL)，每種中藥水提物做3個重復，對照組不添加中藥水提物，28℃振蕩培養(yǎng)，分別在振蕩培養(yǎng)后的6、18、24 h取每種藥水提物藥液試驗組及對照組培養(yǎng)液0.1 mL均勻涂布PDA平板，28℃培養(yǎng)4 d～8 d后，對黃曲霉菌孢子進行計數(shù)，黃曲霉菌胞子孢生長抑制率計算公式為：抑制率(%)=(空白對照組孢子數(shù)-試驗組孢子數(shù))/空白對照組孢子數(shù)×100。

1.2.6 黃曲霉菌產(chǎn)毒量的測定 在無菌條件下，向產(chǎn)毒培養(yǎng)基中均勻涂布2 mL甘油水溶液，待液體完全被吸收，分別接種黃曲霉菌孢子。將不同種類的中藥水提物培養(yǎng)液0.1 mL分別接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)6、18、24 h，同時需做空白對照組。將無菌的生理鹽水和黃曲霉孢子懸液(1×107cfu/mL)按照1∶1比例配合均勻后，取0.1 mL用同樣方法接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，35℃恒溫培養(yǎng)15 d～20 d。每種中藥水提物及空白對照做3個重復并3次試驗結果平均值進行統(tǒng)計與計算。提取黃曲霉毒素，并按照AFB1檢測試劑盒測定其產(chǎn)毒量。霉菌產(chǎn)毒量抑制率(%)=(空白對照組產(chǎn)毒量-試驗組產(chǎn)毒量)/空白對照組產(chǎn)毒量×100。

2 結果

2.1 黃曲霉菌菌落生長抑制率測定結果

由見表1可知，10種清熱解毒的中藥水提取對黃曲霉菌菌落生長有不同程度的抑制效果，培養(yǎng)48 h時，黃連、金銀花、蒲公英、紫花地丁、白頭翁5種藥物水提物對黃曲霉菌菌落生長的抑制率在15.3%～16.9%；隨著黃曲霉菌培養(yǎng)時間的延長，10種清熱解毒的中藥水提取對黃曲霉菌菌落生長抑制效果也有所增加，到培養(yǎng)96 h時，黃連、金銀花、蒲公英、板藍根、紫花地丁、白頭翁6種藥物對黃曲霉菌的抑制率在達到21.4%～22.5%，其他藥物對黃曲霉菌的抑制率在11.4%～15.8%。

表1 10種清熱解毒中藥水提物對黃曲霉菌菌落生長抑制率測定結果

2.2 黃曲霉菌孢子生長抑制率測定結果

由見表2可知，10種清熱解毒的中藥水提物對黃曲霉菌菌孢子生長有不同程度的抑制效果，培養(yǎng)48 h時，黃連、金銀花、大青葉、蒲公英、板藍根、射干、白頭翁7種藥物水提物對黃曲霉菌孢子的抑制率在19.2%～21.1%；培養(yǎng)18 h時，黃曲霉菌孢子抑制效果有所增加；培養(yǎng)96 h時，10種清熱解毒的中藥水提取對黃曲霉菌孢子生長抑制率達到了最高，其中，黃連、金銀花、大青葉、蒲公英、板藍根、射干、白頭翁7種藥物水提物對黃曲霉菌孢子的抑制率在53.1%～75.8%；其他藥物水提物對黃曲霉菌孢子的抑制率在22.5%～39.3%。

表2 10種清熱解毒中藥水提物對黃曲霉菌孢子生長抑制率測定結果

2.3 黃曲霉菌產(chǎn)毒量的測定結果

10種清熱解毒的中藥水提取物對黃曲霉菌產(chǎn)毒量有不同程度的抑制效果，隨著培養(yǎng)時間增長，10種清熱解毒的中藥水提取物對黃曲霉菌產(chǎn)毒量的抑制率也在增長，培養(yǎng)24 h時，10種清熱解毒的中藥水提取物對黃曲霉菌產(chǎn)毒量的抑制率最高，其中，黃連、金銀花、板藍根、射干、白頭翁5種藥物水提物對黃曲霉菌產(chǎn)毒量抑制率較高，為73.3%～89.6%，其他中藥水提物對黃曲霉菌產(chǎn)毒量抑制率為42.6%～50.2%(表3)。

表3 10種清熱解毒中藥水提物對黃曲霉菌產(chǎn)毒量的抑制率測定結果

3 討論

黃曲霉菌素主要的靶器官是肝臟，當動物和人采食了被黃曲霉菌污染的飼料和食品后，黃曲霉菌素蓄積在動物和人的肝臟中，導致肝解毒功能下降，產(chǎn)生的毒素在血液中迅速繁殖，隨著血液循環(huán)造成全身的中毒狀態(tài)[3-6]。黃曲霉菌素不僅會導致動物生長性能和生產(chǎn)性能下降，嚴重死亡，還可以導致人嚴重中毒，甚至致癌變[8-9]。因此，有效控制黃曲霉菌生長和產(chǎn)毒量，才能減少食品和飼料的黃曲霉毒素污染。相關研究表明了乳酸菌等益生菌制劑或者植物提取物對黃曲霉菌落生長、黃曲霉菌孢子生長及產(chǎn)毒量等方面均有一定的抑制效果[10-11]。中草藥具有清熱解毒、清除內毒素、使用安全、低殘留、無毒副作用等優(yōu)點[12]。但是，國內外關于中藥抑制黃曲霉菌生長特性研究沒有報道，因此，本試驗選用了10種清熱解毒中藥水提物對黃曲霉菌落生長抑制率、黃曲霉孢子生長抑制率和黃曲霉產(chǎn)毒量等研究。本試驗結果顯示，培養(yǎng)96 h時，黃連、金銀花、蒲公英等6種藥物水提物對黃曲霉菌菌落生長抑制率為21.4%～22.5%；黃連、金銀花、大青葉等7種藥物水提物對黃曲霉菌孢子的抑制率在53.1%～75.8%；黃連、金銀花、板藍根等5種藥物水提物對黃曲霉菌產(chǎn)毒量抑制率在73.3%～89.6%，從而證實了清熱解毒類中藥對黃曲霉菌落生長、黃曲霉孢子生長、黃曲霉菌產(chǎn)毒量具有較高抑制作用。本研究結果高于姚婉等[10]報道的乳酸菌對黃曲霉菌落生長和黃曲霉孢子生長抑制率?？赡苡捎邳S連、金銀花、板藍根等清熱解毒類的中藥可以抑制黃曲霉菌代謝和細胞壁的合成，從而能抑制黃曲霉菌落及孢子的生長。當黃曲霉菌菌落及孢子生長受到抑制時，黃曲霉菌的產(chǎn)毒量也會受到抑制。清熱解毒類中藥對黃曲霉毒素菌作用機理復雜，有待進一步研究。本試驗為進一步研發(fā)去除食品和飼料中黃曲霉菌復方中藥制劑及應用提供了依據(jù)。