江銀輝，楊碧，吳昌學，周建獎

(貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室，貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

黃曲霉菌(aspergillusflavus，A.flavus)是人類的條件致病菌。對于免疫力低下的人群，黃曲霉菌感染會引起侵襲性曲霉病，造成皮膚、角膜、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的疾病[1]。黃曲霉菌也可引起哺乳動物和鳥類的曲霉病，同時黃曲霉菌侵染多種重要的經(jīng)濟作物、引起田間病害，又可以嚴重危害儲藏過程中的糧食，造成重大的經(jīng)濟損失[2-3]。此外，黃曲霉菌在生長過程中產(chǎn)生大量的次級代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素(aflatoxin)，該毒素是一種具有強烈致癌、致畸作用的微生物毒素，它對糧食、飼料等農(nóng)產(chǎn)品的污染會嚴重危害人類和動物的健康[4-5]。自從 1961 年發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素以來，已確定的黃曲霉毒素有12種以上，均為二呋喃香豆素(difuranocoum)的衍生物[6]。目前臨床上對黃曲霉菌感染的治療主要依賴抗真菌藥物，如兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑及米卡芬凈等[7-8]，但化學藥物容易引起A.flavus的耐藥性；且由于真菌和人體細胞都為真核細胞，所以真菌抗生素類藥物毒性大、副作用強[9]。對黃曲霉菌的功能基因進行研究，能夠更好的闡明其致病和產(chǎn)毒的分子機理，為控制黃曲霉菌的危害具有重要意義[10]。黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建是從分子水平研究黃曲霉菌功能基因的重要工具[11]，本實驗主要目的是采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)介導的方法對黃曲霉菌進行遺傳轉(zhuǎn)化，為研究黃曲霉菌的分子水平研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒 黃曲霉菌株LD-F由貴州醫(yī)科大學附院呼吸科病房空氣中分離得到，pPTRI質(zhì)粒購自Takara(大連)有限公司。

1.1.2試劑 蝸牛酶和纖維素酶為索萊寶(Solarbio)產(chǎn)品，溶壁酶為、潮霉素B(hygromycin B，Hyg)、新霉素(G418)和嘧啶磺胺素(pyrithiamine，PT)3種抗生素均為西格瑪(sigma)產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。溶液1 ∶0.6 mmol/L 氯化鉀(KCl)，50 mmol/L氯化鈣(CaCl2)，10 mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)(pH 8.0)；溶液2 ∶40% (W/V) 聚二乙醇4000(PEG4000)，0.6 mmol/L KCl，50 mmol/LCaC12，10 mmol/L Tris-HC1(pH 8.0)。

1.1.3培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉13 g，蒸餾水加至體積1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。察氏培養(yǎng)基(Czapek Agar, CZ)：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂13 g，蒸餾水加至體積1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。原生體質(zhì)再生培養(yǎng)基：含1 mol/L氯化鈉的CZ培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1黃曲霉菌對抗生素的敏感實驗 將活化的黃曲霉菌分別接種到含有0、50、100、200和400 mg/L Hyg抗生素的CD培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落生長情況，確定Hyg對黃曲霉菌生長的最小抑制濃度；將活化的黃曲霉菌分別接種到含有0、100、200、400和800 mg/L G418抗生素的CD培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落生長情況，確定Hyg對黃曲霉菌生長的最小抑制濃度；將活化的黃曲霉菌分別接種到含有0、0.05、0.1和0.2 mg/L PT抗生素的CD培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落生長情況，確定Hyg對黃曲霉菌生長的最小抑制濃度。

1.2.2黃曲霉菌原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化 接種黃曲霉菌孢子懸浮液于100 mL的CD液體培養(yǎng)基中，用三角培養(yǎng)瓶，30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。用滅菌的擦鏡紙過濾收集菌絲，無菌水清洗菌絲1次，用滅菌的0.8 mmol 氯化鈉清洗1～2次，收集菌絲。用20 mL 0.8 mmol 氯化鈉，10 mmol磷酸鈉(pH6.0)配制酶解液(1%溶壁酶+1%纖維素酶+1%蝸牛酶)，酶液充分溶解后，于10 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清用細菌過濾器抽提2次除菌。將收集的菌絲與酶液混合均勻，置于30 ℃，30 r/min振蕩培養(yǎng)。每30 min用顯微鏡確認狀態(tài)，2 h內(nèi)完成反應(yīng)。待原生質(zhì)體釋放達到足夠的量時，于6 000 r/min，4 ℃，離心10 min。冰上收集沉淀，用0.8 mmol 氯化鈉清洗原生質(zhì)體2次，最后用溶液1懸浮原生質(zhì)體。制得的原生質(zhì)體中加入10%二甲基亞砜，混勻后分裝到滅菌的EP管中，并于-80 ℃保存?zhèn)溆?。取制備好的原生質(zhì)體160 μL置于冰上，然后加入40 μL溶液2，充分懸浮混勻，然后加入20 μg質(zhì)粒(體積不超過20 μL)，冰中靜置30 min，加入1 mL溶液2，輕輕懸浮，室溫靜置20 min，原生質(zhì)體懸浮液與5 mL選擇性再生培養(yǎng)基(0.2 mg/L PT)混合。快速將原生質(zhì)體/軟瓊脂平鋪到選擇性再生培養(yǎng)基平板上30 ℃培養(yǎng)5～7 d。將得到的轉(zhuǎn)化子在選擇性CD培養(yǎng)基(0.2 mg/L PT)上連續(xù)轉(zhuǎn)代5次得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。

1.2.3轉(zhuǎn)化子的鑒定 采用CTAB法提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，根據(jù)ptrA的序列設(shè)計特異引物，上游引物(ptr-k)為5′-GGTACCCAGACGGGCAATTGATTACG-3′,下游引物(ptr-s)為5′-GAGCTCAGCCGCTCTTGCATCTTTG-3′，分別以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株LD-F的基因組DNA為模板進行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增檢測。PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，其中10×PCR buffer(含Mg2+)2 μL，2.0 mmolol/L dNTP 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，50 μg/L模板基因組DNA 1 μL，Taq酶(5 mol/L)0.2 μL，無菌雙蒸水12.8 μL。擴增反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 黃曲霉菌對Hyg、G418和PT抗生素的敏感性

在含有不同濃度Hyg和G418的培養(yǎng)基上，黃曲霉菌均能正常生長，黃曲霉菌株LD-F對Hyg和G418不敏感。PT的敏感性實驗表明，當PT的濃度達到0.2 mg/L時，可以完全抑制黃曲霉菌的菌絲生長，因此PT抗生素可以作為黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的抗性篩選標記，最小抑制濃度為0.2 mg/L。見圖1。

注：A、B、C PT濃度分別為0.05、0.1及0.2 mg/L。圖1 不同濃度PT培養(yǎng)基對黃曲霉菌株LD-F的抑制情況Fig.1 Inhibition of LD-F of Aspergillus flavus by PT medium with different concentration

2.2 黃曲霉菌原生質(zhì)體形態(tài)

酶解反應(yīng)完成后，大部分菌絲已經(jīng)酶解形成斷片原生質(zhì)體、從破碎的菌絲中流出呈圓球狀，在顯微鏡下能夠清晰觀察到黃曲霉菌絲體酶解后形成橢圓型的原生質(zhì)和一些未酶解的菌絲體。見圖2A。

2.3 黃曲霉菌穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定

將質(zhì)粒pPTRI(圖2B)通過PEG介導的方法轉(zhuǎn)入黃曲霉菌株LD-F的原生質(zhì)體后，選擇性再生培養(yǎng)基(含0.2 mg/L PT)平板上成功長出轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率為13個/μg左右(圖2C)。經(jīng)過選擇性CD培養(yǎng)基(含0.2 mg/L PT)的5次篩選，實驗得到穩(wěn)定的黃曲霉菌轉(zhuǎn)化子。PCR檢測結(jié)果表明，黃曲霉菌轉(zhuǎn)化子的基因組中能夠擴增得到ptrA基因片段，片段大小為2.0 kbp(圖3)，表明PT抗性基因ptrA已經(jīng)成功插入黃曲霉菌株的基因組中。

3 討論

轉(zhuǎn)化子的抗性篩選是遺傳轉(zhuǎn)體系構(gòu)建的前提條件，而目前真核生物常見的遺傳轉(zhuǎn)化篩選標記為Hyg和G418[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)黃曲霉菌對Hyg和G418不敏感，但是0.2 mg/L的嘧啶磺胺素能夠完全抑制黃曲霉菌的菌絲生長，因此本研究選取嘧啶磺胺素作為黃曲霉菌轉(zhuǎn)化子的篩選標記。PT的抗性基因ptrA是從具有PT抗性的米曲霉突變株基因組DNA文庫中克隆獲得，目前已經(jīng)應(yīng)用在米曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化的抗性標記[14-15]。

隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，其核心重組DNA技術(shù)已經(jīng)廣泛用于分離和解析真菌的功能基因，并為研究真菌的分子水平調(diào)控提供了一個強有力的工具。目前主要應(yīng)用于絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法有PEG介導原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化法、電穿孔法、限制性內(nèi)切酶介導轉(zhuǎn)化法及根癌農(nóng)桿菌介導真菌轉(zhuǎn)化法等[16-18]。其中，PEG介導原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化方法的前提是要制備絲狀真菌的原生質(zhì)體，因此高效的制備原生質(zhì)體是成功進行絲狀真菌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵和前提[19-20]。本研究顯示，以鮮嫩的黃曲霉菌絲為材料，酶濃度組合為1%溶壁酶+1%纖維素酶+1%蝸牛酶，30 ℃酶解2 h可獲得大量原生質(zhì)體。通過PEG介導質(zhì)粒pPTRI轉(zhuǎn)化黃曲霉菌原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化效率達到13個/μg左右。轉(zhuǎn)代篩選和PCR檢測也表明，抗性基因ptrA已經(jīng)整合黃曲霉菌基因組DNA，并穩(wěn)定表達。

注：A黃曲霉菌原生質(zhì)體，B攜帶ptrA的質(zhì)粒pPTRI，C吡啶硫胺抗性的黃曲霉菌轉(zhuǎn)化子。圖2 原生質(zhì)體介導黃曲霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系Fig.2 Genetic Transformation system of Aspergillus flavus mediated by protoplasts

注：M為DL2000 DNAmarker，1～5為黃曲霉菌轉(zhuǎn)化子，6為質(zhì)粒pPTRI，7為菌株LD-F。圖3 黃曲霉菌轉(zhuǎn)化子PCR分析Fig.3 PCR Analysis of Transformants of Aspergillus flavus

綜上所述，本研究用PEG介導原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化方法具有操作簡單，陽性轉(zhuǎn)化率高，獲得的遺傳轉(zhuǎn)化子性狀穩(wěn)定等特點，為研究黃曲霉菌的功能基因提供技術(shù)基礎(chǔ)。