王博 王蓮萍 楊春雨 國會(huì)艷 魏繼承

（牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，牡丹江 157011）

真核生物的基因表達(dá)與調(diào)控是一系列順式作用元件（Cis-acting element）與反式作用因子（Transacting factor）相互作用的結(jié)果。順式作用元件本身不編碼蛋白，只是基因組中一些特定的區(qū)域，它們需與反式作用因子結(jié)合才能發(fā)揮其生理作用，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄效率［1］。植物在應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)，反式作用因子直接或間接結(jié)合在順式作用元件上，能夠調(diào)控生長發(fā)育、形態(tài)建成、次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，增強(qiáng)防御體制，在應(yīng)對(duì)各種生物和非生物脅迫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用［2］。

近年來，反式作用因子與順式作用元件互作的研究越來越多。有學(xué)者通過酵母單雜交以及凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NAP受到ABA的調(diào)控并直接與其靶基因SAG113啟動(dòng)子上的一個(gè)特定區(qū)域進(jìn)行專一性結(jié)合，SAG113與控制氣孔運(yùn)動(dòng)和水分缺失有關(guān)，為適當(dāng)延長植物的生育期，最終提高農(nóng)作物產(chǎn)量發(fā)揮了重大的作用［3］。劉慧春等［4］運(yùn)用酵母單雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)牡丹（Paeonia suffruticosa）的抗逆轉(zhuǎn)錄因子PsDREB與順式作用元件DRE（干旱應(yīng)答元件）可以特異性結(jié)合，從而提高了植株的抗逆性。Shi等［5］研究發(fā)現(xiàn)DOF轉(zhuǎn)錄因子可以與DOFCOREZM元件結(jié)合，在植物激素響應(yīng)和逆境條件下調(diào)控植物的光合作用。劉縉等［6］運(yùn)用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小麥（Triticum aestivum）的TaPBFB融合蛋白能與麥谷蛋白GluD-LMWGS基因啟動(dòng)子上的順式元件Prolamin-box特異結(jié)合，從而增強(qiáng)小麥的儲(chǔ)存蛋白功能，并為進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。由此可見，轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的相互作用在植物的生長發(fā)育中起到非常重要的作用。

植物轉(zhuǎn)錄因子MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）是近年來發(fā)現(xiàn)的與調(diào)控植物生長發(fā)育、生理代謝、細(xì)胞的形態(tài)和模式建成等生理過程有關(guān)的一類轉(zhuǎn)錄因子［7］。有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)通過研究發(fā)現(xiàn)小麥的TaMYB30-B基因可提高植株在發(fā)芽期和幼苗期的耐旱性［8］。高巍等［9］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GbMYB60基因的過表達(dá)可以提高棉花（Gossypium spp.）幼苗對(duì)高鹽脅迫的耐受性。Lotkowska等［10］發(fā)現(xiàn)擬南芥的AtMYB112受光照調(diào)節(jié)并調(diào)控花青素的積累，強(qiáng)光脅迫時(shí)，AtMYB112表達(dá)量增加，并能促進(jìn)花青素合成過程中的關(guān)鍵因子—花青素貳的合成、降低黃酮醇的合成，從而使花青素合成積累。Campos等［11］發(fā)現(xiàn)番茄（Lycopersicon esculentum）中的ARS1基因有助于減少鹽脅迫下的水分蒸騰損失，可以提高番茄脅迫耐受性而不會(huì)產(chǎn)生產(chǎn)量的損失。

白樺（Betula platyphylla）別名樺木、樺樹。其木材可用于建筑，制作家具、造紙，葉可作染料或煤油，樹皮可提樺皮油、栲膠，樺樹汁液可祛痰止咳、清熱消腫［12］。由于近年來環(huán)境惡化日益嚴(yán)重，白樺的生境越來越困難，因此對(duì)于白樺的遺傳改良工作越來越迫切。前人研究發(fā)現(xiàn)，E-box的核心序列為CANNTG（N：A/G/C/T），參與光響應(yīng)和苯丙氨酸生物合成途徑［13］。前期研究通過以轉(zhuǎn)錄因子為中心的酵母單雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)白樺的BplMYB46轉(zhuǎn)錄因子能夠與一個(gè)E-box順式作用元件（CAAATG）結(jié)合［14］。有研究顯示，E-box的核心序列中間兩個(gè)堿基可能是DNA堿基里的任意一個(gè)。在本研究中，我們將E-box順式作用元件核心序列中間的兩個(gè)堿基進(jìn)行了不同的組合，設(shè)計(jì)正反引物后進(jìn)行雙鏈DNA的復(fù)性并連接到pHIS2載體上，然后通過酵母單雜交技術(shù)篩選與BplMYB46轉(zhuǎn)錄因子能夠特異結(jié)合的E-box順式作用元件，確定中間的兩個(gè)任意堿基的特異性序列，從而為下一步研究BplMYB46轉(zhuǎn)錄因子與下游基因的調(diào)控及為篩選優(yōu)良下游基因改良白樺遺傳性狀奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體 酵母菌Y187，含有pHIS2質(zhì)粒的大腸桿菌，pGADT7-Rec2-BplMYB46質(zhì)粒，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室制備）、TaKaRa公司產(chǎn)品（大連）：Goldview，6×Loading Buffer，DL2000 DNA marker，rTaq 聚 合酶。EcoR I和SacI（NEB公司）、DNA純化回收試劑盒（OMEGA生物技術(shù)有限公司），質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA生物技術(shù)有限公司）。T4連接酶試劑盒（Promega公司），卡那霉素（kan，Sigma公司），3-氨基-1，2，4-三氮唑氨三唑（3-AT，Sigma公司）。

1.1.3 藥品儲(chǔ)存液及培養(yǎng)基制備 藥品儲(chǔ)存液配制：（1）1.1×TE/LiAC ：10×TE 1.1 mL，1 mol/L LiAC 1.1 mL，ddH2O 定 容 至 10.0 mL。（2）PEG/LiAC：50%PEG3350 8 mL，10×TE 1 mL，1 mol/L LiAC 1 mL。（3）3-AT溶液：3-AT粉末用去離子水溶解，儲(chǔ)存濃度為2 mol/L，抽濾滅菌，工作濃度為50 mmol/L，4℃保存。（4）卡那霉素：稱取卡那霉素1 g用無菌水定容至20 mL，用濾器過濾除菌，配制成50 mg/mL的溶液分裝在滅菌的1.5 mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基配制：（1）LB液體（固體）培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L酵母粉，8 g/L瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH為7.0；固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉10 g/L即可。（2）YPDA液體（固體）培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖2%（W/V），腺嘌呤0.003%（W/V）（固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉20 g/L）。（3）SD/DO液體（固體）培養(yǎng)基：酵母氮源（無氨基酸）6.7 g/L，葡萄糖2%（W/V），相應(yīng)缺陷型10×DO母液100 mL/L；固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉 20 g/L即可。缺陷型氨基酸營養(yǎng)包括：DDO：SD/-Leu/-Trp（缺少亮氨酸和色氨酸）；TDO：SD/-His/-Leu/-Trp（缺少組氨酸、亮氨酸和色氨酸）。

1.2 方法

1.2.1 元件雙鏈DNA的合成 設(shè)計(jì)引物并在上下游引物的5′端分別引入核酸內(nèi)切酶（EcoR I）和（SacI）的酶切位點(diǎn)（表1），然后將引物分別稀釋為100 μmol/L 將正反兩條引物復(fù)性成雙鏈DNA片段，反應(yīng)體系，如表2所示。

反應(yīng)條件 ：95℃ 30s，72℃ 2 min，37℃ 2 min，25℃ 2 min。然后用滅菌水進(jìn)行1/100的稀釋。

1.2.2 提取pHIS2載體質(zhì)粒 挑取pHIS2的單個(gè)克隆接種于含有Kan（50 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中于37℃搖床中180 r/min過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒后用EcoR I 和SacI進(jìn)行雙酶切，并純化回收。

1.2.3 連接及轉(zhuǎn)化 將稀釋后的復(fù)性雙鏈DNA片段與切后的pHIS2進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如表3。利用42℃熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。

表1 引物序列

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 連接反應(yīng)體系

1.2.4 PCR菌液鑒定及測序 挑取大腸桿菌轉(zhuǎn)化后的單菌落到加有Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃條件震蕩培養(yǎng)6 h，培育結(jié)束后取10 μL菌液加入PCR小管中，98℃預(yù)變性10 min，冰浴2 min，離心1 min，取1 μL上清液作為模板，進(jìn)行PCR鑒定，引物根據(jù)pHIS2載體上EcoR I 和SacI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)，具體序列如表4。

表4 PCR擴(kuò)增所需引物序列

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，1 min；變性94℃，30 s；退火55℃，30 s；延伸72℃，30 s；反應(yīng)30個(gè)循環(huán)后，后延伸72℃，5 min。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。照相保存。

對(duì)含有目標(biāo)條帶的菌液用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，并測序，測序成功的菌種進(jìn)行保存。

1.2.5 酵母轉(zhuǎn)化 （1）首先用YPDA培養(yǎng)基活化Y187酵母菌，然后制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。（2）每管加入 50 μL 酵母感受態(tài)細(xì)胞、500 μL PEG/LiAc、5 μL 變性的鮭精 DNA（10 μg/μL，98℃變性 5 min）和 5 μL pGADT7-Rec2-BplMYB46質(zhì)粒。（3）分別加入構(gòu)建好的含有E-box順式作用元件的pHIS2載體質(zhì)粒，輕柔混勻（加入5 μL pGADT7-Rec2-p53s質(zhì)粒和5 μL pHIS2-p53s質(zhì)粒作為陽性對(duì)照；加入5 μL pHIS2- p53s質(zhì)粒和 5 μL pGADT7-Rec2-BplMYB46 質(zhì)粒作為陰性對(duì)照）。（4）30℃水浴30 min，加入23 μL DMSO，混勻。（5）42℃水浴15 min，冰預(yù)冷1-2 min；14 000 r/min離心 15 s。（6）棄上清，加入 1 mLYPD Plus Medium重懸酵母細(xì)胞，30℃震蕩培養(yǎng)30 min；14 000 r/min離心15 s，沉淀酵母細(xì)胞。（7）棄上清，加入1 mL 無菌去離子水重懸酵母細(xì)胞。（8）取100 μL菌液分別涂布于SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT固體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3-4 d。

1.2.6 酵母點(diǎn)點(diǎn)驗(yàn)證 （ 1）挑取在SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT平板中生長的單菌落接種在SD/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基中，220 r/min培養(yǎng)16 h。（2）分別測菌液的OD值，12 000 r/min離心15 s，加入無菌水重懸菌液至OD值為2，并稀釋成1/10、1/100、1/1000在SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp+3-AT固體培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)點(diǎn)復(fù)檢。

2 結(jié)果

2.1 載體酶切結(jié)果

使用EcoR I 和ScaI將pHIS2載體進(jìn)行酶切，酶切電泳結(jié)果如圖1。

圖1 酶切結(jié)果

載體在酶切前是雙螺旋閉合環(huán)狀分子，酶切后變?yōu)榫€性分子，線性分子比環(huán)狀分子的電泳遷移速率慢，從圖1中可以看出，酶切后的質(zhì)粒比酶切前的質(zhì)粒遷移速率慢，表明酶切成功。

2.2 PCR鑒定結(jié)果

每個(gè)載體構(gòu)建的大腸桿菌菌落各挑取3個(gè)單菌落搖菌活化，進(jìn)行PCR檢測。根據(jù)pHIS2載體上EcoR I和SacI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的前后序列設(shè)計(jì)載體引物，進(jìn)行PCR菌液檢測，以陽性菌液為模板的PCR擴(kuò)增的DNA條帶要比以pHIS2空載體為模板的PCR擴(kuò)增的條帶分子量大20個(gè)堿基左右。

從圖2中可以看出，泳道1-13、15-18、19、21、23-26、28-30、32-37、40、41和 43-48號(hào) 的PCR擴(kuò)增條帶比對(duì)照分子量大，初步證明這些泳道對(duì)應(yīng)的菌液為陽性結(jié)果，然后將其送到測序公司測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測序序列與已知構(gòu)建的E-box元件序列具有100%的一致性，說明載體構(gòu)建成功。

2.3 酵母單雜交結(jié)果

圖2 PCR鑒定結(jié)果

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，白樺的BplMYB46轉(zhuǎn)錄因子能夠與E-box順式作用元件（CAAATG）結(jié)合。因此，我們將E-box順式作用元件核心序列中間的兩個(gè)堿基進(jìn)行了不同的組合。從圖3中可以看出，E-box的核心序列第3個(gè)堿基為A/T/C時(shí)，酵母轉(zhuǎn)化單菌落在缺陷性培養(yǎng)基TDO/3AT上生長；第4個(gè)堿基為A/G/C時(shí)，酵母轉(zhuǎn)化單菌落在缺陷性培養(yǎng)基TDO/3AT上生長。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，與BplMYB46轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的E-box順式作用元件的特異性序列為CA（A/T/C）（A/G/C）TG。

3 討論

E-box元件是R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子可能作用的元件，參與光響應(yīng)和苯丙氨酸生物合成途徑［13］，該元件最初由Matern和Grimmig運(yùn)用了足跡分析（Footprinting）和凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）從歐芹的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CcoAOMT）基因啟動(dòng)子中鑒出來并加以命名。前期研究發(fā)現(xiàn)，白樺的BpIMYB46轉(zhuǎn)錄因子能夠通過調(diào)控苯丙氨酸裂解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）等與次生壁合成相關(guān)基因的表達(dá)增加木質(zhì)素沉積和次生細(xì)胞壁厚度［15］。我們通過對(duì)BpIMYB46調(diào)控的下游基因啟動(dòng)子上的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，PAL基因啟動(dòng)子上含有多個(gè)重復(fù)的E-box元件，因此推測，E-box元件可能與次生壁合成相關(guān)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將利用實(shí)驗(yàn)手段對(duì)PAL基因在白樺中的功能進(jìn)行更深入的分析，為后續(xù)篩選優(yōu)良基因改良白樺遺傳性狀奠定基礎(chǔ)。

圖3 酵母單雜交結(jié)果分析

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將E-box順式作用元件的雙鏈DNA復(fù)性后連接到pHIS2載體上，并利用酵母單雜交技術(shù)將E-box順式作用元件與BplMYB46轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行結(jié)合分析，結(jié)果顯示，與BplMYB46轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合的E-box順式作用元件的DNA序列為CA（A/T/C）（A/G/C）TG。